logo_ibs.jpg

ВЭЖХ решения и курсы по ВЭЖХ

I.B.S. (EU) / ИП Сычев КС (Россия) • На пути к лучшей хроматографии

  • Facebook Social Icon
   Разработка ВЭЖХ Методик

Новую книгу компании Правильная эксплуатация ВЭЖХ оборудования и колонок (издательство Техносфера) можно приобрести в следующих магазинах >> 

  

Объявлена запись >> на ежегодный двухдневный сборный общий курс ВЭЖХ. Разработка ВЭЖХ методик. Экономика ВЭЖХ разделения. Место и дата проведения - Москва, 16-18 декабря.  

  

Открыта очередь на бесплатное тестирование >> поставляемых ВЭЖХ колонок по модельным смесям стандартных образцов заказчика. 

Основные сферы деятельности компании – это разработка принципиально новых ВЭЖХ методик и трансфер существующих ВЭЖХ методик (в том числе фармакопейных) на оборудование заказчика. За десять лет коммерческих разработок мы успешно выполнили все работы по заключенным контрактам, продемонстрировав 100%-ную эффективность наших подходов.

    Отличительные черты наших рутинных ВЭЖХ методик – высокая надежность и работоспособность при одновременной простоте технического исполнения и предельной экономической эффективности.

Наша компания является единственной на рынке, предлагающей проведение трансфера официальных (фармакопея, ГОСТ), но плохо воспроизводимых или ограниченно пригодных ВЭЖХ методик на оборудование заказчика.

        Мы активно сотрудничаем с такими крупнейшими игроками ВЭЖХ рынка как Merck (США), Advanced Technology Materials (США), Regis Technologies (США), Helix Chromatography (США), Exmere/Grace (Великобритания), Teknokroma (Испания), Sykam (Германия) – что позволяет нам применять в своей работе только лучшие ВЭЖХ колонки и оборудование, лучшие стандартные материалы, и всегда быть на острие наиболее современых ВЭЖХ и УВЭЖХ технологий.

 

Примеры наших ВЭЖХ разделений >>

Список ВЭЖХ колонок, доступных для разработки ВЭЖХ методик >>

Технические особенности наших ВЭЖХ решений >>

Запросить КП на разработку ВЭЖХ методики >>

 

Список ВЭЖХ колонок, доступных для разработки ВЭЖХ методик

 

 

1. Merck/Sigma-Aldrich/Supelco (USA) www.sial.com

 

x1 150x3 2um Ascentis Express C18

x1 150x3 2um Ascentis Express C18 Amide

x1 150x3 2um Ascentis Express ES-Cyano

x1 150x3 2um Ascentis Express Sil

x1 150x3 2um Ascentis Express F5

x1 250x4.6 3um ZIC-HILIC

x1 250x4.6 3um Hibar C18

 

2. Exmere/Grace (UK) www.exmere.eu

 

x1 250x4.6 3um Exsil Pure 120 Amino

x1 250x4.6 3um Exsil Avanti BDS Alkam

x1 250x4.6 5um Platinum C18/PFP

x1 250x4.6 3um Reprosil 100 SCX

x1 250x4.6 5um Reprosil Mixed-Mode Phenyl/Anion

x1 250x4.6 3um Reprosil Mixed-Mode Amino/C8

x1 250x4.6 5um Reprosil Mixed-Mode C8/Cation

x1 250x4.6 5um Reprosil Mixed-Mode Phenyl/Cation

x1 300x8 5um ReproGel 100 PS GPC

 

3. VWR/Avantor (USA) www.ace-hplc.com

 

x2 250x4.6 3um Ace Excel C18 Amide

x1 150x4.6 3um Ace Excel C18 Amide

x2 250x4.6 3um Ace Excel CN-ES

x2 250x4.6 3um Ace Excel SuperC18

x1 150x4.6 3um Ace Excel SuperC18

x1 250x4.6 3um Ace Excel C18-PFP

x2 250x4.6 3um Ace Excel HILIC A

x2 250x4.6 3um Ace Excel HILIC N

x2 250x4.6 3um Ace Excel HILIC B

x1 150x4.6 2um Ace Excel SIL

4. Advanced Materials Technology (USA) www.advanced-materials-tech.com

 

x1 250x4.6 2.7um 100A Halo ES-CN

x1 250x4.6 2.7um 100A Halo RP-Amide 

x1 250x4.6 2.7um 100A Halo AQ-C18 

x1 250x4.6 2.7um 160A Halo ES-CN

x1 250x4.6 2.7um 100A Halo PFP

x1 250x4.6 2.7um 100A Halo HILIC

x1 250x4.6 2.0um 100A Halo HILIC 

 

5. Helix Chromatography (USA) helixchrom.com

 

x1 250x4.6 2.7um Coresep 100 

x1 250x4.6 2.7um Coresep SB 

x1 250x4.6 2.7um Coresep S

x1 250x4.6 2.7um Coresep AP4 

 

6. Regis Technologies (USA) www.registech.com

 

x2 250x4.6 3um Reflect I-Cellulose-B 

x1 250x4.6 3um Reflect I-Amylose-A

 

7. Teknokroma (Spain) www.teknokroma.es

 

x2 250x4.6 3um Tracer Excel 120 APS

x2 250x4.6 3um Tracer Excel 120 Si

x1 250x4.6 3um Tracer Excel 120 Ph

x1 250x4.6 3um Tracer Excel 120 ODSA

x1 250x4.6 5um Tracer Excel 120 ODSA

x1 250x4.6 5um Tracer Excel 120 C8

x1 250x4.6 5um Tracer Excel 120 ODS3

x1 250x4.6 5um Tracer Excel 120 PFP

x1 250x4.6 3um Mediterranea Sea 18

x1 250x4.6 5um Mediterranea Sea 18

 
 

Технические аспекты наших ВЭЖХ решений

 

Современная ВЭЖХ методика для рутинных измерений должна удовлетворять шести основным требованиям.

 

1. Она должна быть как можно более специфичной, то есть основанной на ВЭЖХ приложении с высокой специфичностью разделения и, по возможности, с высокой специфичностью детектирования.

2.  Эффективность и симметрия пиков (для каждого конкретного приложения) должны соответствовать таковым для лучших образцов коммерческих неподвижных фаз на рынке.

3. Время анализа по возможности не должно превышать 15-20 минут для 400 бар насосных систем, или 5-10 минут для 600-1500 бар насосных систем. 

4. ВЭЖХ разделение должно быть изократическим.

5. Подвижная фаза по возможности не должна содержать модифицирующих добавок, особенно органических. Буферы для подвижной фазы должны быть как можно менее агрессивными.

6. Условия проведения хроматографического анализа должны обеспечивать наиболее простую, быструю и незатратную подготовку пробы, а в идеале – отсутсвие пробоподготовки (исключая растворение, фильтрацию и разбавление).

 

Приведенные выше требования описывают некоторый идеальный вариант рутинной ВЭЖХ методики, но именно к такому идеалу мы стремимся при разработке наших ВЭЖХ решений.

        Все шесть требований в тех или иных аспектах улучшают качество рутинной методики, под которым нужно понимать сочетание пригодности методики: ее правильности, специфичности, робастности, чувствительности – и ее экономической эффективности.

 

Фокус на специфичности

Специфичность – это валидационная характеристика методики, от которой напрямую зависит правильность определения. При этом специфичность полностью определяется условиями хроматографического определения, то есть применяемой ВЭЖХ колонкой, составом подвижной фазы и условиями детектирования.

      Таким образом, чем специфичнее ВЭЖХ разделение, тем правильнее результаты определения по соответствующей методике на одном образце, или же шире область применения данной ВЭЖХ методики при фиксированной правильности.

         Оба практических следствия более высокой специфичности означают большую пригодность соответствующих методик, а второе следствие (более широкая область применения) означает еще и более высокую экономическую эффективность.

       Специфичность можно увеличить двумя путями. Самый простой путь состоит в увеличении специфичности детектирования, но он не универсален и далеко не всегда доступен.

           Более универсальный подход состоит в увеличении специфичности хроматографического разделения. В рамках обращенно-фазовой хроматографии (RP HPLC) можно применять более специфичные смешанные обращенно-фазовые режимы (RP/IC, RP/CT, RP/HILIC), или же можно изначально применять более специфичные режимы, такие как гидрофильный режим (HILIC), или ионный режим (IC).

        Чтобы не «потерять» удачные решения при разработке новых приложений для рутинного анализа, в первую очередь подбирают наиболее избирательные условия детектирования, а затем подбирают условия разделения,  начиная с самых специфичных режимов, и заканчивая неспецифичными (например, классической обращенно-фазовой хроматографией).

         Характерным признаком специфичных разделений является их высокая меж-групповая селективность. Другими словами, применение хроматографических условий, в которых окна элюирования различных классов веществ не пересекаются, снижает вероятность наложения сигналов контаминантов на сигналы целевых соединений и, таким образом, способствует увеличению пригодности методик.

       Наилучшие же с экономической точки зрения рутинные разделения получаются в тех случаях, когда удается добиться сочетания высокой меж-групповой селективности с умеренной (то есть не низкой, но и не высокой) внутри-групповой селективностью.

      В этих случаях соединения одного химического класса элюируются достаточно компактными группами, и специфичность разделения комбинируется с высокой скоростью анализа. К примеру, такие решения идеально подходят для определения родственных примесей.

       Примером также может служить HILIC/WCX изократическое разделение антигистаминовых фармацевтиков в комбинированных препаратах, приведенное на рисунке 1. Целевые соединения хорошо отделяются даже от близких по структуре компонентов матрицы (метамизол, декстрометорфан), не говоря уже о нейтральных (парацетамол) и кислых (ксантановая камедь, напроксен) контаминантах. При этом для разделения шести соединений оказывается достаточно всего 1.5 единиц k’ (разделение происходит в интервале k’ = 0.5-2), что на практике может быть реализовано за 6 минут при давлении порядка 250 атм.

 

Высокая эффективность и симметрия пиков

Большой проблемой, не позволяющей добиться значимого прогресса в области разработки рутинных ВЭЖХ методик, является широкое и систематическое применение на практике как непригодных вследствие морального устаревания, так и просто некачественных неподвижных фаз для ВЭЖХ. 

          Отличительным признаком таких фаз является низкая эффективность и низкая симметрия хроматографических пиков для органических оснований и соединений, обладающих хелатирующей способностью.

         Так, в «реальных рабочих условиях» эффективность в несколько тыс.т.т при асимметрии вплоть до 1.5 (ЕР) до сих пор считается нормой в фармацевтике – хотя это совершенно ненормально. Даже при не очень высокой сложности разделений такие низкие значения эффективности могут стать основной причиной крайне низкой правильности измерений.

        Основной технической причиной пониженной симметрии и эффективности хроматографических пиков многих основных соединений является низкая чистота исходного силикагеля, который был применен для синтеза неподвижной фазы. Для работы необходимо применять лишь фазы на основе особо чистых силикагелей (extra-pure silica, > 99.999% или > 99.9999%).

     На рисунке 2 приведен пример ВЭЖХ обращенно-фазового разделения основных соединений различных химических классов (антигипертензивных фармацевтиков) без применения каких-либо модифицирующих добавок в составе подвижной фазы.

Как видно из разделения, все соединения элюируются с симметрией около 1.0 и практически одинаковой (и при этом предельно высокой) эффективностью 30’000-40’000 (удельная эффективность 120-160т.т./м для 3мкм адсорбента соответствует ВЭТТ  8.3-6.3мкм, то есть близко к предельному значению 2dp = 6мкм). Такой результат не является экстраординарным – просто для разделения применяется обращенная фаза на основе высокочистого силикагеля.

        По нашему мнению, следующие значения эффективности являются нормой для современных рутинных ВЭЖХ решений (значения для 400-600 бар насосных систем):

- ионный (IC) режим: 5'000-25'000;

- гидрофильный (HILIC) режим: 10'000-40'000;

- обращенно-фазовый режим (RP): 15'000-60'000;

- нормально-фазовый режим (NP): 15'000-80'000.

 

 

Время анализа

Приведенные значения эффективности вполне достаточны для выполнения разделений средней сложности, требующие значений пиковой емкости порядка 50-70. Более того, для этого вполне достаточно давления не более 300 бар и времени не более 15 минут. К примеру, для 400 бар насосных систем и вязкости, соответствующей смеси вода-ацетонитрил 1:1, для рутинных приложений оптимальны следующие два типоразмера ВЭЖХ колонок:

 

1. 250x4.6 колоноки с 3мкм полностью пористыми частицами при 1.0 мл/мин;

k’ 0.5-5: tR (время анализа) = 250*6/1*0.01 ≈ 15.0 мин;

n (пиковая емкость) = 1+√40’000/4*ln(4) ≈ 70;  

2. 250x4.6 колоноки с 3.5мкм полностью пористыми частицами при 1.5 мл/мин;

k’=0.5-5: tR = 250*6/1.5*0.01 ≈ 10.0 мин;    

n = 1+√25’000/4*ln(4) ≈ 55.   

 

Пример изократического разделения на 400 бар ВЭЖХ системе с оценочной пиковой емкостью n = 60-70 за 15 минут (условия №1) приведен на рисунке 3.

Применение 600 бар насосных систем, которые уже являются современным стандартом, позволяют достичь еще большей пиковой емкости за приемлемое время, либо еще большей производительности при той же сложности разделения:

 

3. 250x4.6 колоноки с 2.7мкм поверхностно-пористыми частицами при 1.25 мл/мин;

k’ 0.75-6: tR = 250*7/1.25*0.01  ≈ 14.0 мин;    

n = 1+√60’000/4*ln(4) ≈ 82;    

4. 250x4.6 колоноки с 2.7мкм поверхностно-пористыми частицами при 1.25 мл/мин;

k’ 0.75-3: tR = 250*4/1.25*0.01  ≈ 8.0 мин;    

n = 1+√60’000/4*ln(2.3) ≈ 52.    

 

Таким образом, даже при весьма солидной пиковой плотности n = 60-70 время анализа при правильно подобранном удерживании не превышает 15-20 минут для 400 бар насосных систем, или 10-15 минут для 600 бар систем.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Изократический режим элюирования  

Еще одной массовой вынужденной ошибкой, приводящей к низкому качеству рутинных ВЭЖХ разделений, является широкое применение градиентного элюирования. Вынужденный характер этой ошибки обусловлен неоправданно широким применением классической обращенно-фазовой хроматографии.

      Обращенно-фазовая ВЭЖХ – это наиболее неспецифичный подход, который помимо низкой меж-группой селективности обладает очень высокой внутри-групповой селективностью.

       Частая необходимость применения градиентных условий элюирования бывает вызвана именно избыточной внутри-групповой селективностью: соединения даже с однотипной химической структурой так сильно разделяются, что не могут быть элюированы с колонки за приемлемое время в изократических условиях. Другими словами, градиентом состава подвижной фазы банально уравновешивают избыток внутри-групповой селективности применяемой обращенной фазы.

           Чем же так плохи градиентные условия для рутинных ВЭЖХ разделений? Главный недостаток связан с тем, что в реальности градиентные методики бывает очень трудно валидировать, а еще большие трудности доставляет их трансфер.

       «Трудно» – это значит с большими затратами времени, приборного времени, реагентов, труда специалистов. Причем все это при посредственном, ненадежном результате, то есть, как правило, низкой робастности (так, селективность зависит от конструкции прибора: жидкостной системы, термостата и теплообменника) и нередко недостаточно высокой специфичности (уменьшение селективности разделения до приемлемого уровня по краям градиента может привести к падению селективности разделения ниже приемлемого уровня на подъеме градиента).

        Также нередки случаи, когда в результате плохо подобранного градиентного профиля быстро выходят из строя элементы насосной и жидкостной системы (забиваются и залипают клапаны, залипают плунжера, забиваются входные фриты колонок). В результате, градиентные методики обладают очень посредственной пригодностью и низкой экономической эффективностью.

         Для рутинных ВЭЖХ разделений лучше применять специфичные изократические ВЭЖХ решения.

В крайнем случае, когда бывает необходимо провести сложное разделение в условиях избыточной внутри-групповой селективности, вместо применения градиентного элюирования необходимо применять неподвижные фазы с наименьшей внутри-групповой селективностью в изократическом режиме.

       В случае обращенно-фазовой хроматографии таковыми являются неподвижные фазы с минимальной метиленовой селективностью; как правило, такие обращенные фазы работают в смешанных обращенно-фазовых режимах: RP/HILIC, RP/CT, RP/IC.

     На рисунке 4 приведен пример изократического разделения смеси в смешанном RP/CT режиме, которое на классической С18 фазе можно провести лишь с применением градиентного элюирования с крутым подъемом градиента.

 

Отсутствие модифицирующих добавок

Одной из отличительных черт устаревших ВЭЖХ методик является широкое применение органических модифицирующих добавок в составе подвижной фазы.

        Модифицирующие добавки в подвижную фазы были всегда мерой вынужденной, своего рода наименьшим из зол. Применяли их в те времена, когда не существовало современного разнообразия различных химий неподвижных фаз, а доступные неподвижные фазы были крайне низкого качества (в первую очередь, низкого качества был исходный силикагель).

         В настоящее время необходимость таких подходов полностью отпала, но их часто применяют «по инерции», не задумываясь, или же сознательно, чтобы «обеспечить переемственность методик».  Ничего хорошего, впрочем, перенять у методик с динамическим модифицированием нельзя. А вот типичные недостатки таких подходов – всегда при них. 

      Все подобные методики очень плохо воспроизводятся, а их робастность оставляет желать лучшего. Специфичность – также их уязвимое место, поскольку системы с динамическим модифицированием могут генерировать много системных сигналов, усложняющих разделение. Кроме того, качественные органические добавки весьма дороги, особенно при рутинном применении, а динамически модифицированную ВЭЖХ колонку можно применять только для одного определенного анализа, в комбинации с одной соответствующей подвижной фазой.

         Среди подходов с динамическим модифицированием наиболее широко известна ион-парная обращенно-фазовая ВЭЖХ, где «сильные» ион-парные реагенты (С6-С10 алкилсульфонаты, додецилсульфат, тетрабутиламмоний), по сути, применяются для получения ионных неподвижных фаз из обращенно-фазовых. Никакой нужды делать так сейчас нет, все подобные разделения можно осуществить на подходящих современных ионных фазах, или же решить все эти задачи другими способами.

        Диэтиламин и триэтиламин (ТЭА) ранее широко применяли для улучшения формы пиков органических оснований – когда, опять же, качество силикагелей были крайне низким. Сейчас в этом также нет никакого смысла.

ТЭА, ТФУ, бутилсульфонат иногда применяют как «слабые» ион-парные добавки для исправления небольших огрехов в разделении (например, не до конца разделенных пар), но это больше напоминает «заплатку» на неработающий метод, чем отдельный серьезный подход.

          Остальные органические добавки применяют для создания буферной емкости: формиат, ацетат, цитрат, ЭДТА. Здесь наиболее опасными добавками являются цитрат и ЭДТА. Они плохо растворимы в любых средах и легко откладываются на различных элементах жидкостной системы, включая клапаны и плунжеры насосов. 

В настоящее время единственными органическими добавками, применение которых имеет смысл для ряда случаев – это формиат аммония и муравьиная кислота. В первую очередь, их применяют в полностью безводных средах или там, где доля водной части минимальна (например, менее 15% в ацетонитриле, или менее 30% в метаноле). 

ВЭЖХ приложения, в которых фигурируют органические добавки, не следует копировать; напротив, желательно переделывать их таким образом, чтобы исключить применение добавок.

         На рисунке 5 приведено разделение катехоламинов с применением подвижной фазы на основе водного раствора кислого фосфата аммония, в то время как «классическая» методика предписывает применение цитратного буфера с добавкой ЭДТА. Таким образом, становится очевидно, что ни цитрат, ни ЭДТА не являются необходимыми для качественного ВЭЖХ разделения катехоламинов.

 

Минимальная подготовка пробы

Как хорошо известно, самая лучшая подготовка пробы – это ее отсутствие. Тактика «dilute-and-shoot» (растворил и инжектировал) абсолютно выигрышна, причем как с точки зрения экономической эффективности, так и с точки зрения простоты исполнения – фактора, критичного для массового потребителя.

      Следуя этой логике при разработке рутинного метода, в первую очередь следует отрабатывать те решения, которые дают минимальную подготовку пробы в сочетании с высокой специфичностью определения. К счастью, эти два ключевых требования к рутинным ВЭЖХ разделениям достаточно часто идут рука об руку, и вероятность встретить такое удачное решение среди всех возможных довольно высока.