I.B.S. (EU) / ИП Сычев КС (сервисы) / АО Найтек Инстр. (оборудование) 

   Открытые ресурсы,
жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Новую книгу компании Правильная эксплуатация ВЭЖХ оборудования и колонок (издательство Техносфера) можно приобрести в следующих магазинах >> 

  

Объявлена запись >> на ежегодный двухдневный сборный общий курс ВЭЖХ. Разработка ВЭЖХ методик. Экономика ВЭЖХ разделения. Место и дата проведения - Москва, 16-18 декабря.  

  

Открыта очередь на бесплатные пробные анализы смесей СО Заказчика >>  на поставляемых нами ВЭЖХ колонках

 

Учебники по жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) компании с 2010-2019 гг.

Книга "Авторские ноу-хау в ВЭЖХ". Переиздание 2019г. >>

Книга "Практический курс ВЭЖХ". 2013г.>>

Книга "Подготовка пробы в ВЭЖХ и ГХ". Переиздание 2019г.>>

Книга "Практическое руководство по ВЭЖХ". 2010г.>>

 
 

Организация операционных процессов в фармацевтических лабораториях.

Часть 1. Применение принципов бережливого производства к производству изменений методом ВЭЖХ. Agile подходы «гибкой разработки» для быстрого преодоления системных ограничений и кризисов в заводских лабораториях ОКК и НИР

К.С. Сычев*, Е.К. Левков**, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

** Levkov Ltd., G.Britain

 

«…По отечественным оценкам,

количество недовольных российских менеджеров

еще больше, более 80%. Это недовольство выражается

в отсутствии связи между планами, исполнением,

результатами и мотивацией».

 

– Википедия, «Ключевые показатели эффективности»

 

 

      Заводская лаборатория является звеном производственной цепочки; эффективность ее функционирования критически сказывается на показателях эффективности всего предприятия.

      В статье показывается важность процессного подхода для увеличения эффективности работы лаборатории и успешного внедрения GMP, а также рассматриваются варианты организации операционных процессов ВЭЖХ лаборатории, основанные на принципах бережливого производства.

      Для выработки решений по преодолению системных ограничений функционирования лабораторий предлагается применять адаптированные принципы теории ограничений (TOC). Для быстрого снятия системных кризисов в цепочке «производство-лаборатория» предлагается применять адаптированные принципы Agile (гибкой разработки) с проверкой решений методом proof of concept (PoC).

 

1. Введение. Лаборатория как высокотехнологичное производство

 

Основным условием устойчивости любого бизнеса является автоматизация наибольшего числа существующих бизнес-процессов, в том числе – операционных. Рынки становятся более конкурентными, и в таких условиях задача автоматизации процессов приобретает первостепенную важность. Компании, преуспевающие в автоматизации производства и сбыта, способны захватывать новые доли целевого рынка у менее эффективных компаний на «ручном управлении».

Для наиболее бурно растущей отрасли IT с ее нематериальной наукоемкой продукцией такая возможность роста – это реалии не просто сегодняшнего, а уже вчерашнего дня. Компания может захватить нишевый рынок или потерять его буквально за несколько лет.

Если говорить о фармацевтическом производстве, то низкотехнологичное (соответственно, низкорентабельное) производство вполне может выживать и на ручном управлении – при условии равного технологического уровня конкурентов. Но для более рентабельного, высокотехнологичного и наукоемкого, производства максимизация ключевых показателей финансовой эффективности (чистой прибыли и окупаемости инвестиций) напрямую требует автоматизации операционных процессов.

Во многом это связано с тем, что «внутри себя» такое производство само продуцирует, обрабатывает и использует значительное число нематериальных продуктов, прежде всего технологий и производственных процессов. Причем эти нематериальные активы лежат в основе производства, то есть определяют, в том числе, рентабельность производства физического.

Если смотреть с этой точки зрения, то заводская лаборатория – это не просто одно из рядовых звеньев в производственной цепочке, а отдельное высокотехнологичное «производство в производстве». И даже более того – это отдельный самостоятельный бизнес, способный не только выходить на самоокупаемость, но и генерировать прибыль.

Лаборатория производит два вида продукции. Во-первых, это различные виды измерений, включая:

- входной контроль закупаемых субстанций и реагентов;

- производственный контроль и исследования в области производства лекарственных форм: растворимость, деградация;

- производственный контроль и исследования в области органического или биотехнологического синтеза субстанций;

- выходной контроль продукции (дозировки, примеси и деграданты).

 

Во-вторых, это методики и связанные с ними производственные процессы:

- разработка рутинных методик контроля (дозировка, примеси и деграданты, растворимость);

- разработка исследовательских методик и проведение исследований (например, идентификация, выделение, расшифровка примесей и деградантов в субстанциях);

- валидация методик;

- трансфер методик;

- разработка лабораторных СОПов.

 

 При этом все перечисленные продукты – нематериальные и наукоемкие, то есть все сказанное об автоматизации бизнес-процессов касается заводских лабораторий в первую очередь.

 

 

2. Концепция бережливого производства. Управление бизнес-процессами (BPM) лаборатории. Принцип «золотого молотка» как антипаттерн. Важность процессного анализа для успешного внедрения GMP

 

Снять лабораторию с «ручного управления» можно только опираясь на профессиональные стандарты качества и применяя хорошо известные и проверенные управленческие подходы.

Стандартным управленческим подходом является Business Process Management, BPM (управление бизнес-процессами). И, хотя он хорошо знаком специалистам в области финансов, IT, телекоммуникаций и страхования – ни фармацевтическое производство, ни лаборатории до сих пор не используют его в значительной мере.

Наиболее близким по смыслу набором принципов и методик оперируют отраслевые системы менеджмента качества, СМК (quality management system, QMS), которые внедрены на многих производствах, в том числе лабораториях; помимо фокуса на качество продукции, СМК подразумевает также непрерывное снижение затрат на увеличение качества.

Общей базой для BPM, QMS и ряда других управленческих подходов (например, Agile) является концепция бережливого производства (lean production), которая была сформулирована в 1950-х годах американскими исследователями феномена компании Тойота.

Суть концепции бережливого производства состоит в том, что каждый из отдельных аспектов производства должен приносить ценность конечному потребителю. Приносит ли ценность потребителю качество продукции и качество коммуникации с производителем? Безусловно. На этом направлении фокусируются QMS, а в фармацевтической отрасли – стандарты GMP.

Приносит ли ценность потребителю меньшая стоимость продукции при том же качестве? Тоже приносит. Как раз на этом направлении фокусируется BPM.           

Если некоторый аспект производства бесполезен для конечного покупателя, то от него необходимо избавляться тем или иным образом. Например, для аналитической лаборатории, морально устаревшую – медленную, ресурсозатратную и неточную – аналитическую методику необходимо менять на быструю, незатратную и более точную. Таким образом, покупатель будет больше уверен в качестве лекарства, а заплатит за него – меньше.

На данный же момент, к сожалению, при организации лабораторий значительно чаще применяют антипаттерн – принцип золотого молотка (golden hammer): «попытки повторно использовать устаревшую, но все еще работающую вещь или идею будут продолжаться до тех пор, пока она не станет причиной катастрофы».

Так, к примеру, широкое распространение получает подход, когда все вопросы организации новой лаборатории, включая все управленческие и финансовые аспекты, перепоручают некоторому кандидату на пост начальника лаборатории, которого привлекают со стороны через кадровое агентство. Дословно: «Мы ищем начальника лаборатории, чтобы он нам объяснил, как все надо делать».

Это сложно поддается разумному объяснению, учитывая, что все финансовые показатели лаборатории и производства планируется поставить в зависимость от мнения, по сути, случайного человека. Который, кроме того, что не знаком с текущими операционными процессами лаборатории, и что его компетентность как минимум не проверена на деле, с большой долей вероятности будет использовать в своей работе именно принцип «золотого молотка».

Он будет принимать решения, не разобравшись в процессах лаборатории – то есть именно то, чего от него будет ожидать руководство. И в какой-то момент все это приведет к катастрофе.    

Управление бизнес-процессами может быть реализовано эффективно лишь при внедрении процессного подхода в среде собственных сотрудников. При этом сотрудники должны быть мотивированы, достаточно компетентны на своих позициях, им должна нравиться своя работа и они должны быть хорошо знакомы с текущими бизнес-процессами предприятия.

«Жизненный цикл» BPM начинается с выявления неэффективных бизнес-процессов и выработки возможных решений (design). Далее следуют: оценка решений и выбор наиболее оптимального варианта действий (modeling), исполнение (execution), мониторинг (monitoring) и оптимизацию (optimization).

Технические нюансы исполнения BPM могут различаться, но, основываясь на собственном опыте, мы можем дать две основные рекомендации по внедрению BPM в лаборатории.

Для начала, чтобы избежать превращения хорошей идеи в квест по инновациям в сфере закупок стикеров и ручек, необходимо выработать стратегию развития лаборатории. Причем, стратегия должна быть реальной (по целям, срокам и бюджету), а критерии – исчислимыми (должны быть заданы метрики). Какие цели можно ставить, какие процессы развивать, какие критерии использовать – эти вопросы как раз разбираются в статье.  

Во-вторых, также должен существовать процесс управления бизнес-процессами, то есть должно быть понятно – кто из специалистов принимает участие в BPM, на каком из этапов он присоединяется к обсуждению и относительно каких вопросов  он компетентен.

Самый сложный этап BPM – первый, который, фактически, состоит из двух частей: выявления неэффективных бизнес-процессов (процессный анализ, или process mining) и разработки возможных решений по увеличению эффективности (solution delivery).

В свою очередь, процессный анализ (process mining) можно разделить на три подэтапа:

- обнаружение бизнес-процессов (business process discovery, BPD),

- анализ производительности (performance analysis, PA),

- проверка соответствия бизнес-процессов (business process conformance checking, BPCC).

На предприятиях, где BPM не внедрен, цикл начинается с обнаружения бизнес-процессов. Идентификация наиболее критичных бизнес-процессов, которые следует улучшать в первую очередь, происходит в процессе их анализа. И вывод о соответствии или несоответствии выделенных бизнес-процессов метрикам происходит на последнем этапе. В конечном итоге, «несоответствующие» процессы признаются недостаточно эффективными и подлежат улучшению.

Для принятия решений и для обсуждения прогресса на стадиях мониторинга и оптимизации имеет смысл создать совет технических специалистов и экономистов с решающим правом голоса топ-менеджера, например, технического директора, директора по качеству или генерального директора.

Успех этапа процессного анализа (process mining) во многом зависит от мотивации наиболее квалифицированных специалистов предприятия, которые должны быть заинтересованы топ-менеджментом в инициировании BPM. Без этого хорошая идея, опять же, останется только на бумаге. Помощь консультантов со стороны может оказаться плодотворной на данном этапе, но в этом случае консультанты должны работать в плотном взаимодействии с сотрудниками заказчика.

Напротив, на стадии разработки решений по увеличению эффективности процессов и технологий (solution delivery) целесообразно активно привлекать именно специалистов или организации со стороны.

Логика проста – взгляд сотрудников может быть в значительной мере «замылен» постоянной рутиной, а обозначенный вопрос требует свежего взгляда со стороны. Поэтому для формирования портфеля предложений по увеличению эффективности производства вполне допустимо обращаться к внешним консалтинговым ресурсам.

При внедрении любых улучшений на фармацевтическом производстве, включая лабораторию, важно помнить, что все бизнес-процессы должны соответствовать нормам GMP. Вообще, в лабораториях, где GMP только внедряется, этот набор жестких, но справедливых требований часто рассматривают как «убийцу эффективности». Менеджмент и технические специалисты жалуются на огромное количество новых «бюрократических» процедур, критически снижающих эффективность лабораторий.

Такая ситуация возникает по той причине, что GMP пытаются внедрить в лабораториях, для управления которыми не используют процессный подход. Если собственные бизнес-процессы непонятны и неэффективны, искусственное добавление новых бизнес-процессов, очевидно, и дальше снижает эффективность лаборатории, а главное – де-факто не способствуют улучшению качества, превращая GMP в бюрократическую формальность.

Таким образом, организация BPM всегда должна предшествовать внедрению GMP. Если лаборатория применяет BPM, то в ходе улучшения операционных процессов (измерений, СОПов) и технологий (методик) будет повышаться и их качество – в результате чего лаборатория будет удовлетворять требованиям любой системы менеджмента качества автоматически, без каких-либо специальных усилий. 

 

3. Проверка решений методом PoC. Примеры проверки эффективности новых подходов при разработке и модернизации ВЭЖХ методик

Для оценки работоспособности предложений по увеличению эффективности целесообразно использовать метод проверки концепции (proof of concept, PoC). Проверка концепции – это демонстрация практической осуществимости какого-либо метода, идеи, технологии с целью доказательства факта, что они работают. В рамках демонстрации строят опытный прототип или модель, не обязательно являющиеся полноценными продуктами, но подтверждающие принципиальную возможность создания таковых.

Этот подход исключает возможность совершения ошибок при принятии решений, поскольку проверяет то или иное решение непосредственно на специальном опыте. С экономической точки зрения подход очень эффективен, поскольку при минимальных затратах почти полностью исключает риски при внедрении решения на производстве.

 

Пример 1. Для аналитической лаборатории фармацевтического предприятия, менеджмент которой интересовался возможностью внедрения более производительных ВЭЖХ методик, компания провела специальный двухдневный тренинг, который, по сути, являлся проверкой концепции. Цель тренинга была в том, чтобы на примере трех ВЭЖХ методик продемонстрировать возможность пятикратного увеличения производительности при одновременном увеличении специфичности и пределов определения.

Изначально такая возможность казалась менеджменту нереальной, а специалистам – по меньшей мере, спорной, но опыт позволил развеять их опасения.

Пример 2. В другой лаборатории не получалось провести определение целевых соединений в сложных матрицах (мазях) существующими методами даже с применением сложной пробоподготовки. Понадобился опыт, чтобы доказать, что при правильном выборе ВЭЖХ режима анализ может длиться всего несколько минут при идеальной специфичности и отсутствии пробоподготовки. 

            Лаборатория потратила два года и значительные ресурсы на проведение экспериментов, чтобы разработать более-менее работающую процедуру подготовки пробы. В результате, эта процедура оказалась не нужна. При этом опыт по проверке концепции занял не более двух часов.

            Пример 3. Фармацевтическая компания была заинтересована в разработке методики для определения следовых количеств целевого соединения в биообразцах для фармакокинетических исследований. Лаборатория ОКК была укомплектована только стандартным ВЭЖХ оборудованием, но компания была готова пойти на приобретение дорогого ВЭЖХ-МС оборудования в случае успешной разработки методики.

            Однако сторонним организациям так и не удалось разработать работоспособную ВЭЖХ-МС методику. При этом нашей компании удалось разработать методику с применением стандартного ВЭЖХ оборудования.

            Проверка концепции заняла неделю и потребовала определенных финансовых затрат. Тем не менее, эти затраты составили несущественную часть (менее 1%) от стоимости оборудования, которую фармацевтическая компания уже была готова приобрести. Таким образом, экономия средств в этом проекте составила 99%, то есть экономическая эффективность проекта была улучшена, по меньшей мере, в сто раз.   

Пример 4. Корпоративные ВЭЖХ курсы нашей компании включают, помимо трех дней теории, два дня практической работы, в течение которых могут быть проверены любые концепции, касающиеся увеличения эффективности ВЭЖХ методик и операционных процессов лаборатории.

            Два дня, полностью посвященных проверке концепций, существенным образом экономят ресурсы лаборатории и фактически окупают стоимость самих курсов. При этом усваиваемость материалов теоретического ВЭЖХ курса также возрастает – по причине их закрепления в течение двух дней интенсивных практических занятий.

 

4. Заводская лаборатория как часть производственной цепочки. Теория ограничений (TOC) и ее следствия

Ключом для успешного и быстрого выявления неэффективных бизнес-процессов в заводской лаборатории является принятие факта, что она является частью производственной цепочки. Когда лаборатория становится «узким местом» производства, то в какой-то момент оно останавливается, и вызванные простоем производства  издержки по порядку величины превосходят собственные издержки лаборатории на порядок, или даже на порядки.

Непонимание этого ключевого факта приводит к локальным оптимизациям, когда под эгидой увеличения экономической эффективности урезают средства производства лаборатории. В итоге такая тактика ведет к катастрофе.

Локальные оптимизации происходят всегда, когда дается команда на сокращение издержек, но влияние производимых действий на ключевые показатели финансовой эффективности при этом никак не оценивается. К сожалению, на данный момент этот сценарий можно наблюдать очень часто, в значительном проценте случаев.

Не менее плохим сценарием является «заливание проблемы деньгами», когда проблему «узкого места» в производстве видят, но пытаются решить ее экстенсивными методами. В основе здесь также лежит отсутствие оценки влияния производимых действий на ключевые показатели финансовой эффективности компании.

Более того, этот вопрос иногда просто не успевают поставить – потому, что решения принимают в авральном порядке, и нет времени что-либо оценивать и проверять. Это и есть «ручное управление» в чистом виде, антипаттерн концепции бережливого производства.

«Ручное управление» отчасти спасает ситуацию, но очень слабо, очень высокой ценой и только в краткосрочной перспективе. В долгосрочной перспективе деньги заканчиваются, начинаются локальные оптимизации, и катастрофа наступает еще быстрее. Негибкая, привыкшая к избыточному финансированию и работающая с огромными издержками, система просто не успевает адаптироваться к новым условиям и «ломается».

Почему локальные оптимизации, ровно как и «заливание деньгами», заканчиваются провалом, и как правильно с точки зрения бережливого производства увеличивать пропускную способность «узких мест» производственной цепочки – на эти вопросы есть ответы, и дает их теория ограничений (theory of constraints, TOC).

Общий ответ на последний вопрос таков: не стоит «расширять» «узкое место» производства экстенсивно; надо выявлять конкретные ограничения системы, а затем управлять ими. В том числе, в рамках управления ограничением, необходимо вставлять в цепочку перед звеном с ограничением некоторый «буфер» активно потребляемого ресурса, защищающий звено от перегрузки в непредвиденных случаях.

Любая заводская лаборатория имеет два общих ограничения.

Первое ограничение. Лаборатория не может произвести необходимое для производства измерение, потому что не имеет необходимой технологии.

Второе ограничение. Лаборатория не может увеличить производство измерения с применением существующей технологии и операционных процессов без значительных инвестиций в основные фонды.

            Для управления этими ограничениями и создания «буфера» для сглаживания пиковых нагрузок необходимо разобраться в том, что из себя представляет технология для лаборатории на фармацевтическом производстве, и какие операционные процессы защищают ее от перегрузок.

Организация операционных процессов в фармацевтических лабораториях.

Часть 2. Экономика ВЭЖХ разделения

 

К.С. Сычев*, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

2.1. Ограничения для лаборатории ОКК. ВЭЖХ решение как технология. Примеры управления ограничениями лаборатории ОКК. С чего начать, создавая новую лабораторию

 

Основные ограничения лаборатории ОКК, препятствующие ее нормальному функционированию при пиковой нагрузке, или же делающие невозможным резкое увеличение ее производительности без значительных инвестиций в основные фонды, сводятся к следующему списку: 

  1. отсуствие необходимых технологий, или недостаточный уровень существующих технологий, 

  2. недостаточная методическая подержка,

  3. недостаточная техническая поддежка.

 

Технологией для лаборатории ОКК является комплекс, состоящий из ВЭЖХ методики, подходящих для нее колонки и оборудования. Другими словами, технологией является готовое ВЭЖХ решение, а не просто ВЭЖХ методика. 

Метод ВЭЖХ отличается от других аналитических методов тем, что результат измерения и с технической, и с экономической точки зрения определяется в основном методикой и колонкой, а не оборудованием, вклад которого в конечное решение гораздо меньше.

Как ни странно, если ВЭЖХ решение простое и надежное, то успех его внедрения мало зависит и от профильного образования персонала – здесь важнее становится умение аккуратно и быстро работать руками (проводить взвешивание, растворение, разбавление и т.д.)

Как показывает практика, все ограничения в конечном итоге сводятся к отсутствию у лаборатории необходимой ВЭЖХ методики и соответствующей ей ВЭЖХ колонки, или их низкому качеству, которое приводит к ограниченной пригодности аналитического решения, или его низкой экономической эффективности.

Таким образом, эффективное управление технической и методической поддержкой в общем случае также сводится к воздействию на применяемое ВЭЖХ решение. Это происходит потому, что причина потребности в этих, по сути, внешних ресурсах кроется именно в недостатках применяемых технологий.

Если ВЭЖХ решение адекватное, то лаборатория ОКК не будет нуждаться ни в методической поддержке, ни в технической поддержке в негарантийных случаях – поскольку последние просто не будут случаться.

Приведем несколько примеров, когда необходимость технической или методической поддержки может быть устранена модернизацией существующих ВЭЖХ решений.

 

Пример 1: лаборатории требуется техническая поддержка.

«Залипающие» клапана – это вечная проблема лаборатории ОКК, и фактически основная причина простоя ВЭЖХ оборудования по негарантийной причине.

Для борьбы с залипающими клапанами делают что угодно: заставляют химиков долго промывать насос водой (прибор простаивает пару часов), долго кипятить клапана с ультразвуком (прибор простаивает день), и в итоге позволяют заменить клапана на новые (прибор простаивает от трех дней до трех месяцев, поскольку никто не заказал запасные клапана заранее). Но ни один из этих способов не решает проблемы, поскольку ни один из этих способов не воздействуют на причину неисправности.

Настоящей причиной «залипания» является выпадение в осадок на элементах клапанов неорганических солей из буфера в результате неправильно подобранного состава подвижной фазы.

Среди факторов, способствующих «залипанию» клапанов, можно выделить:

- применение в подвижных фазах калиевых или натриевых солей, … 

- … особенно в сочетании в высой долей органического растворителя в подвижной фазе, ...

- и особенно в сочетании с метанолом.

«Классическим случаем» засорения клапанов является градиентное элюирование до 100% органического растворителя при смешивании его напрямую с фосфатным буфером.

Наконец, особо тяжелыми случаями являются применение цитратного буфера, либо добавок в буфер ЭДТА. Это чревато высаждением цитратов (или солей ЭДТА) на плунжер с последующим выходом из строя всей головки насоса, которую можно только заменить на новую.

Чтобы эти негарантийные случаи больше никогда не беспокоили лабораторию, необходимо провести коррекцию методик, по которым идет работа. А именно, необходимо:

- избегать любых добавок, образующих нерастворимые соли; избегать методик, в которых применяют подобные подвижные фазы,

- калийные и натриевые соли необходимо заменить на аммониевые,

- не использовать в качестве органического растворителя метанол,

- помнить, что 50мМ фосфат аммония совместим с долей ацетонитрила до 60%, а 20мМ фосфат аммония – с долей ацетонитрила до 80% максимум,

- при градиентном элюировании либо останавливать градиент на 80% ацетонитрила, либо переходить на чистый ацетонитрил через воду (для этого понадбятся три линии: буфер, вода и ацетонитрил),

- в конце серии анализов тщательно, объемом 10-100 мл, промывать насос водой, отсоединив колонку; особенная тщательность необходимо при переходе с кислого буфера на нейтральный, в высокосолевого буфера на подвижную фазу с высокой долей ацетонитрила и т.д.

 

Пример 2: лаборатории требуется техническая поддержка.

Бывает, что на каком-либо анализе колонки живут недолго, быстро «умирают». Здесь причина может заключаться и в плохой методике, и в некачественных колонках.

Существуют методики, при разработке которых были допущены откровенные ошибки; соответственно, вина таких методик в «быстрой смерти» колонок не вызывает сомнений. К таковым сразу же можно причислить все методики на силикагельных колонках и с применением щелочных подвижных фаз. Надо понимать, что декларируемая многими производителями «устойчивость при щелочных рН» – это всего лишь реклама, далекая от действительности.

Другой вариант – это методики со 100% водной подвижной фазой и также силикагельной колонокой. Если колонка не эндкеппирована (то есть, это, скорее всего, ионная колонка), то ее «быстрая смерть» в чистом буфере вполне закономерна – подвижная фаза должна содержать не менее половины органического растворителя, причем ацетонитрила, а не метанола.

Если речь идет об оборащенно-фазовой хроматографии, то время жизни для любой колонки, формально даже устойчивой к деветтингу (фазовому коллапсу), также будет значительно ниже ожидаемой. Причем, быстрее всего выйдут из стороя колонки с некачественным силикагелем, а качественные неподвижные фазы продержатся дольше всего.

Если колонка постоянно засоряется, точнее, засоряется ее входной фрит, то причина также заключается в методике. В таких случаях необходимо либо изменять процедуру пробоподготовки, либо вообще отказываться от решения и разрабатывать другую методику с применением условий, в которых осаждение компонентов матрицы на фрите колонки происходить не будет.

Таким образом, необходимо соблюдать следующие предосторожности:

- избегать щелочного рН при работе на силикагельных колонках,

- избегать обращенно-фазовых методик с применением 100% водных подвижных фаз,

- избегать методик, при работе по которым активно засоряются фриты колонок.

Лучшим же вариантом, особенно для ОКК без отделов НИР, является применение специализированных колонок в сочетании с условиями разделения, рекомендуемыми производителем. В этом случае возможность «быстрой смерти» колонки будет сведена к минимуму.

 

Пример 3: лаборатории требуется методическая поддержка.

Самые большие проблемы при трансфере бывают связаны с градиентными методиками. Градиенты плохо воспроизводятся, и на это есть причина: градиентное элютрование – это процесс неравновесный и, следовательно, по определению нестабильный.

Главная неприятность заключается в том, что градиентное разделение зависит от конструктивных особенностей того ВЭЖХ оборудования, на котором было получено. В особенности это касается устройства насосной системы и термостата колонок.

Методическая поддержка может понадобиться лаборатории ОКК в том случае, когда на установленном приборе не удается воспроизвести разделение в условиях, приведенных в методике. К сожалению, даже опытный специалист мало чем может здесь помочь. Фактически, в данном случае разделение оптимизируют, измененяя конфигурацию жидкостной системы прибора, причем никогда нельзя точно прогнозировать результат того или иного действия.

Единственный надежный способ избежать проблем при трансфере градиентных методик и связанной с этим необходимостью в методичесой поддержке – это использовать в работе только изократические методики.

Соответственно, разработку новых рутинных методик также целесообразно проводить в изократическом режиме. Старые градиентные методики можно модернизировать таким образом, чтобы они работали в изократическом режиме элюирования.    

 

Пример 4: лаборатории требуется методическая поддержка.

Другая частая проблема при трансфере методик связана с ион-парными разделениями. В этом случае плохая воспроизводмость методик связана с тем, что ионная неподвижная фаза производится из обращенно-фазовой методом динамического модифицирования, то есть непосредственно путем кондиционирования обращенно-фазовой колонки подвижной фазой, содержащий добавку ионного модифицирующего реагента.

          Процесс динамического модифицирования имеет много тонкостей, требует некоторой сноровки и терпения хроматографиста (кондиционирование может занимать от нескольких часов до нескольких дней). Очень многое зависит от точного совпадения углеродной нагрузки применяемой исходной обращенной фазы с данным показателем для той фазы, на которой была разработана методика. Если различие существенно, то разделение, скорее всего, будет невозможно воспроизвести даже путем коррекции состава подвижной фазы.

          Если ион-парное разделение все же необходимо воспроизвести и провести трансфер методики, то не следует перекладывать эту задачу на плечи сотрудников ОКК – здесь потребуется смешательство сотрудников отдела НИР, или внешнего подрядчика.

И, разумеется, ион-парную хроматографию не следует применять для разработки новых методик. Вместо нее можно применять ионную или гидрофильную хроматографию, а также хроматографию в смешанном обращенном-ионном режиме на специальных ВЭЖХ колонках.

По аналогии с градиентными методиками, старые ион-парные методики можно модернизировать таким образом, чтобы они работали в обычных, не ион-парных режимах.  

 

Приведенные примеры касаются лишь наиболее грубых ошибок, допускаемых при разработке ВЭЖХ методик. Вцелом же, разного рода погрешности, приводящие к ухудшению экономической эффективности ВЭЖХ методик, распространены почти повсеместно. В особенности это наблюдение справедливо для методик, взятых из открытых источников, в том числе имеющих официальный статус.

Вот лишь основные факты, не приняв в учет которые, лаборатория ОКК, не имеющая отдела НИР и не привлекающая внешние ресурсы для разработки и модернизации методик, рискует оказаться в катастрофическом положении.

 

1. Почти все методики, взятые из открытых источников, непригодны. Источники не имеют значения, ими могут быть:

- data sheets производителей ВЭЖХ оборудования и колонок,

- статьи в реферируемых журналах,

- статьи и советы «из интернета».

Ориентироваться на такие «методики» – значит уже начинать «работу» с катастрофы. 

2. Значительная доля методик, приведенных в официальных источниках, непригодна. Еще большая их доля пригодны лишь формально, поскольку их очень сложно воспроизвести. Это звучит, возможно, угрожающе, но это – реальность, с которой приходится считаться.

3. Почти все методики, приведенные в официальных источниках, экономически неэффективны. Как правило, они выполнены на низком техническом уровне с применением морально устаревших материалов и подходов на уровне 70-90 годов прошлого века.

 

На первый взгляд, эти факты обескураживают. Но, по здравому рассуждению, все это выглядит очень логично, поскольку работающая, современная, экономически эффективная методика – это дорогая технология, которую никто не поместит в открытый источник для бесплатного доступа.

Более того, независимая лаборатория, обладающая подобной методикой, может не согласиться продать ее ни за какую разумную цену, поскольку для нее значительно более рентабельно будет продавать измерения, выполненные по этой методике.

          Таким образом, если у крупных лабораторий есть отделы НИР, которые даже в условиях ограниченных полномочий могут если не разрабатывать собственные, то адаптировать нерабочие методики и консультировать ОКК, то лаборатории ОКК без отдела НИР, столкнувшись в нерабочей методикой из открытого источника, просто не смогут ничего поделать.

В результате, многие лаборатории ОКК совершенно незаслуженно показывают очень низкую эффективность – потому что они вынуждены работать по непригодным или плохо пригодным методикам и на недостаточно качественных ВЭЖХ колонках.

          В зоне самого большого риска оказываются новые лаборатории ОКК, открываемые, как правило, на сравнительно некрупных производствах. Такие лаборатории создаются, как правило, в тех случаях, когда:

- лаборатория на аутсорсинге не может справиться с возрастающими объемами,

- лаборатория на аутсорсинге предоставляет сомнительные данные анализов,

- стоимость анализов от лаборатории на аутсорсинге получается выше, чем стоимость своей собственной лаборатории ОКК.

          Однако, в этом случае очень важно, чтобы создание лаборатории начиналось именно с управления ограничениями, то есть с закупок необходимых ВЭЖХ решений и продумывания обеспечения лаборатории технической поддержкой, а не с закупки оборудования. Как правило, в подавляющем случае все делается наоборот, откуда и возникают все проблемы молодых лабораторий.

 

 

2.2. Ловушка «пригодности ВЭЖХ методики». Какое ВЭЖХ решение может считаться в действительности пригодным для работы

 

          При выборе методики анализа для работы многие администраторы и даже специалисты могут попасть в ловушку фразы «пригодный ВЭЖХ метод», которая является прямой калькой с английского «… HPLC method is suitable (for the intended purpose)».

Здесь надо понимать, что этот перевод дословный, но абсолютно не аутентичный, то есть при переводе искажается исходный смысл этой фразы. «ВЭЖХ методом» могут называть всего лишь некоторые условия ВЭЖХ  анализа, которые авторы метода единожды подобрали и решили опубликовать.   

Допустим, на авторском анализируемом образце разделение оказалось специфичным, что дало авторам возможность декларировать специфичность методики. Но писать «специфичная методика» не принято – принято писать «пригодный метод». Возможно, немного утрируя – но это всего лишь шаблонная фраза.

Итак, некто подобрал условия для разделения своего образца на своей колонке и опубликовал результат со своей целью. Никто не утверждал, что этот метод получится воспроизвести в другой лаборатории, или даже в другой стране, на другом оборудовании. Никто не утверждал, что этот метод можно будет воспроизвести спустя много лет, да и не думал никогда об этом – поскольку технологии улучшаются, и опубликованный подход, очевидно, быстро устареет. И тем более никто не гарантировал, что метод вообще способен показать специфичность на каких-либо иных образцах, кроме образца автора.

Но фраза «пригодный ВЭЖХ метод» вводит в заблуждение, и вот уже текст спускают в лабораторию с требованием провести трансфер метода. И тогда происходит катастрофа.

Следует понимать, что «некоторый способ» становится «пригодной методикой» лишь при соблюдении определенных необходимых и достаточных условий. Без их соблюдения даже «методика» с официальным статусом будет являться лишь «некоторым способом» с официальным статусом, но, тем не менее, не методикой.   

          Необходимым условием, без выполнения которого методика просто не может называться таковой, является наличие протоколов валидации специфичности на каком-либо типичном образце или типичных образцах. Эти протоколы являются доказательством того, что методика не выдумана. При этом трансфер метода начинают с воспроизведения разделений с протоколов валидации специфичности, а основной задачей трансфера является получение протоколов специфичности для всех типов образцов, которые предполагается анализировать в данной лаборатории на данном оборудовании.

          Вот список достаточных условий:

- для методик на примеси должны быть приведены протоколы валидации пределов определения, с информацией о марке оборудования и указанием результатов его операционной квалификации,

- должны быть приведены протоколы валидации робастности. Кроме стандартного протокола должны быть, по возможности, проведены испытания с применением двух или более одинаковых ВЭЖХ колонок из разных серий разного времени выпуска; при этом, все колонки не должны быть произведены слишком давно (например, более пяти лет назад) и долго держать на складах,

- для методик в градиентном режиме элюирования в обязательном порядке должна быть приведена информация о марке оборудования и приведены результаты его операционной квалификации (задержка градиента, форма градиента). В обязательном порядке должна быть валидарована робастность разделения при температурных колебаниях,

- для всех методик должны быть указаны не только условия хроматографического разделения, но и условия промывки и кондиционирования новой ВЭЖХ колонки, взятой «с нуля» со склада.

Однако, даже необходимая специфичность не делает методику пригодной в полном смысле этого слова. Покажем это на простых примерах.

ВЭЖХ методика контроля с применением ВЭЖХ-МС не будет пригодна для применения в лаборатории, не имеющей такого оборудования и не собирающейся его приобретать.

Методика со сложной пробоподготовкой будет непригодна для небольшой «полевой» лаборатории, не обладающей ни необходимым общелабораторным оборудованием, ни высококвалифицированным персоналом.

Ни для кого не будет пригодна формально специфичная методика, но реализованная таким образом, что колонки быстро «умирают» и требуют замены, клапана постоянно залипают, разделение нестабильно и то появляется, то исчезает, воспроизводимость площади пика то есть, то его по непонятным причинам нет.

Все перечисленные симптомы могут быть как проблемами отдельно методики, так и проблеми всего комплекса: методики в сочетании с данной хроматографической колонкой и данным оборудованием – то есть хроматографического решения.

Несомненно, вклад ВЭЖХ методики будет максимальным и определяющим, но и от надлежащего качества оборудования, и особенно ВЭЖХ колонки, будет зависеть многое.

Пример 1. Например, если методика подразумевает достаточно агрессивные условия хроматографирования (рН менее 3, высокая концентрация солей, повышенная до 50-60°С температура при низкой доле органического растворителя), то гидролитическая устойчивость неподвижной фазы будет являться определяющим условием пригодности решения.

Пример 2. Для определения фармацевтиков с хелатными свойствами, склонными к элюированию в виде асимметричных пиков, необходимо применять наиболее качественные неподвижные фазы с высокой химической инертностью исходного силикагеля.

Вот примеры, касающиеся особенностей оборудования.

Пример 3. В ионной хроматографии белков часто применяют градиенты солей до 200мМ и выше. На таких подвижных фазах насосные системы с тонкими плунжерами и мелкими шариками и седлами в клапанах быстро выходят из строя, то есть на такие методики необходимо ставить наиболее надежные насосные системы с большими клапанами.

Пример 4. На нормально-фазовые разделения необходимо ставить изократические насосы без клапанной коробки и дегазатора, но с заземлением головки насоса.

Пример 5. В случаях работы на повышенных до 50-60°С температурах термостат колонок должен комплектоваться производительным теплообменником «нулевого объема».

 

Только если все элементы ВЭЖХ решения: методика, ВЭЖХ колонка и ВЭЖХ оборудование – являются согласованной системой, ВЭЖХ решение может считаться в полной мере пригодным.

 

 

2.3. Экономика ВЭЖХ решения. Столкновение интересов при разработке экономически эффективных решений 

 

Однако, даже пригодное решение может быть как более, так и менее экономически эффективным.

На рисунке 1 в виде блок-схемы отображены основные факторы, определяющие экономическую эффективность ВЭЖХ решения, а также показана их взаимосвязь.

Экономическая эффективность ВЭЖХ решения, таким образом, определяется четырьмя факторами:

- необходимостью инвестиций в основные фонды, в основном – в необходимое оборудование,

- надежностью решения,  то есть способностью решения функционировать стабильно, без неожиданных «сюрпризов», сложностей,

- затратами времени и ресурсов на подготовку пробы,

- производительностью ВЭЖХ решения (для ВЭЖХ методики этот фактор сводится к специфичности ВЭЖХ разделения).

 

 

Рисунок 1. Блок-схема, описывающая реальную многофакторную зависимость экономической эффективности ВЭЖХ решения от различных параметров, диктуемых ВЭЖХ методикой, ВЭЖХ колонкой и оборудованием.

 

 

Очень часто экономически неэффективные решения в фармацевтическом анализе связаны с применением при разработке морально устаревших подходов и неподвижных фаз релиза 70-90-х годов прошлого века.

Такие решения приводят:

- к низкой специфичности разделений из-за невысокого качества неподвижных фаз (специфичность разделения →  эффективная пиковая плотность → пиковая плотность → химическая инертность неподвижной фазы),

- склонности к необоснованно долгим разделениям и градиентным режимам элюирования по причине недостаточной селективности разделений классических С18 фаз (специфичность разделения →  селективность разделения →  режим элюирования),

- низкой надежности разделений по причине невоспроизводимости свойств неподвижных фаз (надежность решения → невоспроизводимость от партии к партии), а также невысокого времени их жизни, особенно в агрессивных условиях, часто применяемых для разделения плохо удерживаемых соединений на обращенных фазах  (надежность решения → время жизни колонки → стабильность колонки, отказ от агрессивных подвижных фаз),

- низкой надежности разделений по причине часто и необоснованно применяемого градиентного элюирования (надежность решения → режим элюирования) и ион-парных разделений.

- низкой надежности разделений по причине применения подвижных фаз, способствующих негарантийному выходу из строя насосных систем ВЭЖХ оборудования (надежность решения → отказ от агрессивных подвижных фаз).

          Эти проблемы усугубляются в том случае, когда перед лабораторией ставят вопрос по повышению объема производства измерений, а качество внедренных ВЭЖХ решений оставляют невысоким – то есть, говоря языком теории ограничений, не управляют ограничением, а пытются его искусственно «расширить». Попытка «залить проблему деньгами» приводит лишь к резкому росту затрат на основные фонды, тогда как настоящая проблема кроется в низкой специфичности разделений (инвестиции в основные фонды → специфичность разделений).

          Инвесторы могут успокаивать себя надеждой, что ВЭЖХ оборудование является хорошей инвестицией, но это совершенно не соответствует действительности. Оборудование, как и помещения, являются лишь очень дорогостоящим пассивом, не приносящим ни прибыли, ни ценности, а активом являются лишь экономически эффективные аналитические решения.

          Рутинные ВЭЖХ решения должны быть изократическими, высокоселективными и специфичными, с применением «мягких» буферных растворов без различного рода добавок, с применением наиболее качественных современных ВЭЖХ колонок с самой высокой химической инертностью.

Внедрение хороших рутинных решений способствует снятию функциональных ограничений с лабораторий ОКК без потери средств на значительные инвестиции в основные средства.    

          Еще один фактор экономической эффективности ВЭЖХ решений связан с процедурой подготовки пробы, необходимость которой часто возникает при анализе образцов со сложными матрицами методом классической обращенно-фазовой хроматографии вместо более целесообразных специфичных режимов: ионного, гидрофильного, смешанных режимов (минимальная подготовка пробы → применение специфичных режимов).

          Подготовка пробы насколько ресурсозатратна, и настолько ухудшает экономические показатели ВЭЖХ решения, что от нее необходимо уходить любыми возможными способами. Логика разработки ВЭЖХ решения анализа сложной матрицы должна идти не от выбора условий разделения к необходимой для этого подготовке пробы, а от выбора условий без пробоподготовки к решению задачи по специфичному хроматографическому определению в условиях без подготовки пробы.

          Продвижению более современных материалов и оборудования для анализа активно способствует реклама, но слепое следование рекламе также не способствует экономической эффективности решений. Большую осторожность следует проявлять в тех случаях, когда производители связывают экономическую эффективность решения только с более «быстрой» ВЭЖХ колонкой или прибором, то есть пытаются продать очень упрощенное видение проблемы, например, такое, как на рисунке 2.

 

 

Рисунок 2.  Упрощенная схема понимания эффективности ВЭЖХ решения, часто продвигаемая в рекламных кампаниях производителей ВЭЖХ оборудования и колонок.

 

 

 

Увеличение давления не приведет к даже к формальному ускорению анализа, если методика реализована на устаревших колонках, или имеет длительную подготовку пробы – и тем более не приведет к повышению экономической эффективности в тех случаях, когда решение изначально ненадежно и недостаточно специфично.

          Попытка же трансфера устаревшей методики с применением устаревшей колонкой на новую современную «быструю» колонку, скорее всего, закончится провалом. Во-первых, далеко не всегда такой трансфер возможен в принципе. Во-вторых, не имеет никакого смысла переносить плохую методику на другую колонку, а потом долго ее отлаживать. Гораздо проще бывает с самого начала разрабатывать экономически эффективные решения на подходящих ВЭЖХ колонках, главными свойствами которых являются, прежде всего, необходимая селективность и химическая инертность – а вовсе не совместимость с высоким давлением.

Надо хорошо осознавать, что, в конечном счете, ни производитель оборудования, ни производитель колонок не заинтересованы в экономической эффективности ВЭЖХ решений – потому что такие решения приводят к сокращению их продаж.

В разработке экономически эффективных ВЭЖХ решений заинтересованы, прежде всего, инвесторы и топ-менеджмент предприятий, поскольку эффективные решения резко улучшают основные финансовые индексы (KPI, key performace index) предприятия – окупаемость инвестиций (ROI, return on investment) и срок окупания инвестиций (PP, pay-back period).

Исполнителями проектов может выступать собственный отдел НИР предприятия, или сторонний подрядчик. При этом задача должна быть поставлена таким образом, чтобы исполнитель был заинтересован в оптимизации решения для достижения его максимальной экономической эффективности.

Наибольшая трудность на этом пути состоит в том, что химики в отделах НИР привыкли решать несколько иную задачу, а именно, разрабатывать формально пригодные методики на имеющемся оборудовании и имеющихся колонках, но не на тех колонках, которые необходимо использовать для достижения экономического эффекта.

Этому способствуют и типичные курсы и учебники по ВЭЖХ, в которых также приведена в лучшем случае весьма упрощенная схема понимания эффективности ВЭЖХ решения, далекая от реальной жизни (например, такая, как на рисунке 3).   

 

 

Рисунок 3.  Упрощенная схема понимания эффективности ВЭЖХ решения, продвигаемая в большинстве курсов и учебниках по ВЭЖХ.

 

          Столкновение точек зрения, продиктованных рекламой (рис. 2) и учебниками (рис. 3), в условиях реальной многофакторной ситуации (рис. 1) и является, по сути, основным ограничением, связанным с отделом НИР. Но об этом – уже в следующем номере.

 

 

Об авторе

 

Константин С. Сычев – автор пяти книг и более трех десятков работ по ВЭЖХ и подготовке пробы с более чем двадцатилетним опытом в области ВЭЖХ и разрабоки ВЭЖХ методик.

В начале карьеры работал под руководством одного из наиболее известных мировых ученых в области ВЭЖХ, лауреата наград Мартина-Синджа и Нернста-Цвета Вадима А. Даванкова, и получил научную степень за работы в области исследования новых неподвижных фаз и развитие методологии исследования механизмов удерживания. Основное научное достижение – строгое доказательство связи удерживания в режиме «с переносом заряда» (charge transfer HPLC) с параметрами π-системы удерживаемых соединений.

С 2008 года – индивидуальный предприниматель, специализиующийся на проведении корпоративных курсов по ВЭЖХ и разработке ВЭЖХ методик. С 2017 года – директор компании Integrated BioSeparation Solutions, Эстония (I.B.S., www.hplc.today, www.hplc.today/rus). Основная деятельность компании – разработка ВЭЖХ методик и поставка кастомизированных ВЭЖХ комплексов на базе оборудования Sykam (Германия), а также брендовых ВЭЖХ колонок линеек I.B.S.pharm и I.B.S.nutri.

 
 

Квалификация ВЭЖХ колонок как часть квалификации оборудования. 

Часть 1. Тестовые испытания колонок для обращенно-фазовой ВЭЖХ

К.С. Сычев*, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

Обсуждается важная роль квалификации неподвижной хроматографической фазы при разработке, трансфере и повторной валидации аналитических методик. Описана процедура квалификации обращенных фаз, которые применяются для подавляющего большинства ВЭЖХ-измерений в производственной практике данного аналитического метода. Тестирование обращенно-фазовой ВЭЖХ-колонки позволяет получить всю необходимую информацию о ее качестве и проявляемых адсорбционных свойствах. Предложены критерии оценки качества и методика классификации обращенных фаз согласно их селективности.

 

 

Введение

Современная аналитическая лаборатория, сертифицированная в одной или нескольких системах менеджмента качества (СМК), должна соблюдать основополагающий принцип прослеживаемости любого аналитического измерения.

 Измерение (испытание) становится прослеживаемым, если любые инструменты или процессы, участвующие в его производстве, можно проследить до какого-либо общепринятого и признаваемого стандарта. Чтобы обеспечить выполнение этого принципа в любой аналитической лаборатории, необходимо пройти следующие этапы: квалификация оборудования и протоколов обработки данных; верификация стандартных образцов; валидация аналитических методик.

Подобный подход вполне приемлем для большинства физико-химических методов анализа. Тем не менее, он не вполне релевантен для хроматографических методов, и в особенности – для жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Хроматография как аналитический метод имеет важную особенность. В отличие, к примеру, от спектральных методов, где аналитический сигнал зависит от двух составляющих: прибора и методики измерения, в хроматографии он определяется уже тремя факторами: прибором, методикой и – применяемой хроматографической колонкой.

На практике часто встречается восприятие хроматографической колонки как расходного материала, что в корне неверно. По сути, колонка – основная часть аналитического инструмента, которую, к сожалению, необходимо достаточно часто заменять. Именно колонка производит аналитическое разделение, а «остальной» прибор лишь обслуживает этот процесс – такое утверждение более чем справедливо для приборов с широко применяемыми на практике одноканальными детекторами, не способными предоставлять дополнительную спектральную информацию об определяемых соединениях. 

Таким образом, квалификацию хроматографической колонки следует рассматривать как отдельную самостоятельную процедуру, являющуюся обязательной частью квалификации хроматографического оборудования.

 

Необходимые для квалификации соответствующей колонки данные о свойствах неподвижной фазы (НФ) следует получать, применяя хроматографическое разделение специально подобранных смесей индивидуальных веществ. Квалификационный тест должен предоставлять следующую информацию о хроматографической колонке: эффективность хроматографической колонки; данные о химической инертности неподвижной фазы (т.е. ее способность элюировать специально подобранные тестовые соединения в виде узких симметричных пиков); данные о повторяемости свойств неподвижной фазы применяемой коммерческой марки от партии к партии (batch-to-batch reproducibility).

Последний пункт, по сути, раскладывается на два подпункта. Свойства неподвижных фаз можно считать идентичными в том случае, если у них совпадают:

  • удерживание соединений в доминирующем хроматографическом режиме. Например, в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии способность НФ к удерживанию соединений определяется ее гидрофобностью, то есть тест обращенных ВЭЖХ-фаз должен оценивать их гидрофобность;

  • тип неподвижной фазы по характеру проявляемой селективности. То есть тест должен давать оценку вкладов минорных хроматографических режимов в результирующую селективность.

Результаты квалификационного теста должны быть достаточны для оценки четырех характеристик колонки: способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем ВЭЖХ-режиме, тип НФ по характеру демонстрируемой селективности, химическую инертность НФ и эффективность колонки.

Цель данной работы состоит в том, чтобы продемонстрировать возможность квалификации наиболее широко применяемых на практике обращенно-фазовых (ОФ) ВЭЖХ-колонок с помощью теста, разработанного специалистами нашей компании.

 

 

Экспериментальная часть 

 

Тестовая смесь состоит из следующих шести соединений: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин; чистота их должна быть достаточна, чтобы на хроматограмме не появлялись сигналы, мешающие определению параметров хроматографических пиков.

Подвижная фаза состоит из ацетонитрила, 50мМ водного раствора NH4H2PO4 и фосфорной кислоты, смешанных в объемном отношении 23,75:76,25:0,1. Детектирование проводят при помощи диодно-матричного или двухволнового сканирующего УФ-детектора на двух длинах волн – 270 нм (синяя линия на рисунках) и 330 нм (красная линия на рисунках).

Для каждой тестируемой колонки должно быть предварительно измерено нулевое (мертвое) время; в нашей работе для этих целей применялась щавелевая кислота. Стоит отметить, что этот способ определения нулевого времени не универсален; он дает значительную ошибку в том случае, если тестируемая НФ проявляет ионообменные свойства.

В работе были протестированы (квалифицированы) следующие обращенно-фазовые НФ:

 

  • C18: SunShell C18 2,6 μm; Reprosil-Pur C18-AQ 3 μm; SiliaChrom dtC18 3 μm; ProteCol C18-HQ105 5 μm; Inertsil ODS 5μm; Luna C18(2) 5 μm; Reprosil-Pur C18-AQ 5 μm; Reprosil-Pur ODS-3 3 μm; ReproSpher C18-Aqua 5 μm; Reprosil-Pur Basic C18 5 μm; Reprosil ODS-A 5 μm; YMC ODS-AQ 5 μm; Stability ODS-2 5 μm; SunFire C18 5 μm; Atlantis dC18 5 μm; XBridge C18 5 μm; Gemini C18 5 μm; Hypersil ODS; XTerra RP18 5 μm; Symmetry C18 5 μm; SupelcoSil LC18-DB 5 μm; SupelcoSil LC18 5 μm; Alltima C18 3 μm; Zorbax XDB C18 5 μm; Synergi Max-RP 4 μm; Synergi Polar-RP 4 μm; Kinetex C18 2,6 μm; Synergi Hydro-RP 4 μm; Zorbax SB-C18 5 μm; Kromasil 100 C18 5 μm;

  • обращенные фазы с полярной группой (polar embedded group): Zorbax Bonus-RP 5 μm; Discovery Amide C16 5μm; Reprosil Amid C16 3 μm; Supelcosil ABZ+ 5 μm; SymmetryShield RP18 5 μm;

  • PS/DVB: PRP-1 5 μm;

  • PHM: (полигидроксиметакрилат): Shodex ODP2 HP-4E 5 μm;

  • PYE: (пиренил силикагель): Cosmosil 5PYE 5 μm;

  • C8: Luna C8(2) 5 μm;

  • PFP: Reprosil Fluosil PFP 5 μm;

  • C30: Reprosil C30 5 μm.

 

Изначально предполагали, что разработанная процедура предназначена для тестирования любых НФ с доминирующим обращено-фазовым режимом удерживания.

Тест также должен подходить для оценки вклада в результирующую селективность таких дополнительных (минорных) режимов, как гидрофильный (HILIC) и режим с переносом заряда (CT).

Обращенно-фазовые/ионообменные фазы мы рассматривали как фазы с доминирующим ионным режимом, и по этой причине не подвергали квалификации по описанной процедуре.

Фактор удерживания 5-метилфурфурола применяли в качестве параметра, отражающего способность НФ к удерживанию соединений в доминирующем (обращенно-фазовом) ВЭЖХ-режиме. На рисунках этот параметр обозначен как «RP retention index» (индекс удерживания по обращенно-фазовому механизму).

Эффективность хроматографической колонки рассчитывали также по пику 5-метилфурфурола. Химическую инертность неподвижной фазы оценивали по фактору асимметрии пика кониферилового альдегида.

 

 

Результаты и обсуждение

 

Ключевое преимущество предлагаемого для квалификации НФ теста – определение [T1] селективности НФ по двум независимым (ортогональным) параметрам. В подавляющем большинстве применяемых на сегодняшний день тестах селективность НФ характеризуется всего одним параметром. Кроме того, в традиционных тестах единственный отражающий селективность параметр не имеет ясного физического смысла, поэтому часто называется неоднозначным термином «силанольная активность».

В предлагаемом тесте оба параметра имеют ясный физический смысл и привязаны к химической структуре адсорбента и адсорбата. Первый параметр (примесь гидрофильного механизма, HILIC) отвечает за селективное увеличение относительного удерживания более полярных (гидрофильных) адсорбатов; второй параметр (примесь механизма за счет переноса заряда, CT) отвечает за селективное увеличение относительного удерживания соединений с π-системами, в том числе – ароматическими.  

Рассмотрим тестовое разделение, полученное на обращенной фазе с С18 привитым силикагелем и с интенсивным неполярным энд-кеппингом, которая демонстрирует «традиционную» ОФ-селективность (рис. 1). Пары ванилин/5-метилфурфурол (селективность α ≈ 1,15) и конифериловый альдегид/этилванилин (α ≈ 1,23) хорошо разделяются; ванилин элюируется до 5-метилфурфурола, а конифериловый альдегид элюируется до этилванилина.

Мы обнаружили, что обращенную селективность пары ванилин/5-метилфурфурол можно использовать для оценки вклада в удерживание гидрофильного механизма (при доминирующем обращенно-фазовом); эту величину далее обозначим как «RP/HILIC selectivity index» (обращенно-фазовый/гидрофильный индекс селективности). Для «традиционной» С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,15 = 0,87.   

По аналогии, для оценки вклада в удерживание механизма с переносом заряда (при доминирующем обращенно-фазовом) можно использовать обращенную селективность пары конифериловый альдегид/этилванилин; эту величину далее обозначим как «RP/CT selectivity index» (обращенно-фазовый/переносно-зарядный индекс селективности). Для «традиционной» С18-обращенной фазы он имеет значение порядка 1/α ≈ 1/1,23 = 0,81.

 

 

 

Рис.1. Тест «традиционных» С18-обращенных фаз с интенсивным неполярным энд-кеппингом

(Вверху) а) Kromasil 100 C18 (AkzoNobel), 250×4,6; 5 мкм. Скорость потока: 1,0 мл/мин.

(Внизу) б) SunShell C18 (ChromaNik Technologies Inc.), 100×4,6; 2,6 мкм поверхностно-пористая НФ. Скорость потока: 1,5 мл/мин.

Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин.

 

 

Величина обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности («RP/HILIC selectivity index») составляет порядка 0,85-0,88 для C18-фаз с интенсивным неполярным энд-кеппингом, 0,90-0,95 – для С18-фаз с умеренным неполярным энд-кеппингом (рис. 2), 1,2-1,4 – для C16/C18-фаз с полярной группой (polar embedded group) типа С16-амидной (рис. 3) и[T2]  порядка 1,65 – для фаз на основе полигидроксиметакрилата (рис. 6). 

 

 

 

Рис. 2. Тест С18-обращенных фаз с умеренным неполярным энд-кеппингом.

(Вверху) а) SiliaChrom dt C18 (SiliCycle Inc.), 250×4,6; 3 мкм. Скорость потока: 1.0 мл/мин.

(Внизу) б) Kinetex C18 (Phenomenex), 150×4,6; 2,6 мкм поверхностно-пористая НФ Скорость потока:  1,5 мл/мин.

Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин.

 

 

Величина обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности («RP/CT selectivity index») составляет порядка 0,80-0,87 для C18-фаз, 0,95-1,05 – для пентафторфенильной (PFP) фазы, С30-фазы и С18-фазы с п-нитрофенильным энд-кеппингом, а также порядка 1,2 – для пиренильной (рис. 5) и полигидроксиметакрилатной (см. рис.6) фаз. Для алкил-привитых фаз эта величина увеличивается в ряду C8 (≈ 0,70), C18 (≈ 0,85), C30 (≈ 1,03).

 

 

 

Рис. 3. Тест C16-амидной фазы.

ReproSil Amid C16 (Dr. Maisch GmbH), 250×4,6; 3 мкм. Скорость потока: 1,2 мл/мин.

Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин

 

 

 

Рис. 4. Тест C18-фазы с полярным энд-кеппингом.

ReproSpher 100 C18-Aqua (Dr. Maisch GmbH), 250×4,6; 5 мкм. Скорость потока:  0,75 мл/мин.

 Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин.

 

 

 

 

 

 

Рис. 5. Тест пиренильной (PYE) фазы.

CosmoSil PYE (Nacalai Tesque, Inc.), 250×4,6; 5 мкм. Скорость потока:  1.0 мл/мин.

Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин.

 

 

 

Рис. 6. Тест полигидроксиметакрилатной фазы.

Shodex ODP2 HP-4E (Shodex), 250x4,6; 5 мкм. Скорость потока: 0,75 мл/мин.

Адсорбаты: (1) фурфурол, (2) сиреневый альдегид, (3) ванилин, (4) 5-метилфурфурол, (5) конифериловый альдегид, (6) этилванилин.

 

 

Таким образом, при помощи описанного теста можно как проводить идентификацию типа применяемых обращенных фаз, так и отслеживать воспроизводимость их адсорбционных свойств (то есть удерживание в обращенно-фазовом режиме и два вида селективности за счет дополнительных адсорбционных механизмов).

Если отложить величину обращенно-фазового/гидрофильного индекса селективности по одной оси, а величину обращенно-фазового/переносно-зарядного индекса селективности – по другой, и расположить на этой координатной плоскости данные по селективности различных обращенных фаз (рис. 7), можно увидеть, как однотипные НФ группируются согласно проявляемой селективности.  

 

 

 

Рис. 7. Классификация обращенных фаз согласно проявляемой ими селективности.[T3] 

 

Помимо селективности при помощи этого теста можно оценить индекс удерживания, который изменяется от фазы к фазе закономерно и предсказуемо. Так, для полностью пористых фаз индекс удерживания (3,55 и 3,15) оказывается значительно выше, чем для соответствующих поверхностно-пористых фаз (2,22 и 1,94, см. рис. 1, 2).

Индекс удерживания С18-фаз с интенсивным энд-кеппингом (3,55) оказывается больше индекса для С18-фаз с умеренным энд-кеппингом (3.15), который выше индекса для С18-фаз с полярным энд-кеппингом (2,25), который в свою очередь больше такового для С16-амидных фаз (1,97).      

Химическую инертность неподвижных фаз можно оценить, ориентируясь на величину фактора асимметрии пика кониферилового альдегида. Конифериловый альдегид – слабо хелатирующее соединение, пик которого начинает «хвостить» в том случае, когда матрица адсорбента загрязнена примесями металлов, то есть является недостаточно качественной.

На рис. 8 приведены значения факторов асимметрии пика кониферилового альдегида для различных марок обращенных НФ на основе силикагеля. По нашему мнению, обращенная фаза, синтезированная на основе качественного, современного силикагеля, должна демонстрировать (в данном тесте) фактор асимметрии пика кониферилового альдегида не более, чем 1,10.    

 

 

 

 

 

Рис. 8. [T4] Оценка химической инертности обращенной фазы по фактору асимметрии пика кониферилового альдегида

 

 

Таким образом, применение описанного теста позволяет выполнить весь спектр задач, стоящих при квалификации обращенно-фазовой ВЭЖХ колонки.

 

 

Заключение

 

Квалификация НФ - крайне необходимая процедура, как при разработке или валидации методик на месте, так и при рутинной работе по валидированным методикам.

Перед разработкой методики очень важно обладать самой полной и точной информацией о химии применяемой НФ и, соответственно, о ее адсорбционных свойствах. Надпись же на колонке, сделанная производителем, далеко не всегда соответствует ее содержимому. Однако именно на маркировку, по сути, ориентируются аналитики при выборе той или иной колонки.

Это в корне неверно, поскольку надпись лишь обозначает торговую марку. Свойства же НФ на практике могут отличаться в рамках одной торговой марки; более того, такая ситуация встречается все чаще и чаще. По идее, производитель должен нести ответственность за плохую воспроизводимость свойств НФ (batch-to-batch reproducubility), но в реальности этого не происходит, в первую очередь – по причине высокой брендовой ориентации рынка НФ.

В этих условиях тестирование неподвижной фазы согласно определенной, достаточно информативной процедуре незаменимо для обеспечения прослеживаемости хроматографического измерения.

Квалификация НФ должна предшествовать процедуре разработки или трансфера аналитической методики, а также проходить каждый раз при ревалидации аналитической методики в связи с заменой хроматографической колонки.

 

Квалификация ВЭЖХ колонок как часть квалификации оборудования. 

Часть 2. Тестовые испытания колонок для гидрофильной (HILIC) и ионной ВЭЖХ

К.С. Сычев*, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

 

Предложен оригинальный метод тестирования полярных колонок на основе силикагеля в условиях реализации ионной, гидрофильной и смешанной ионной-гидрофильной ВЭЖХ. Он позволяет оценивать и сравнивать физико-химические и эксплуатационные характеристики колонок: удерживание по гидрофильному механизму, знак и величину заряда ионита, определяющих удерживание в ионной хроматографии и селективность в смешанной ионной-гидрофильной ВЭЖХ, химическую инертность полярных неподвижных фаз на основе силикагеля и эффективность упаковки полярных колонок. Обсуждаются условия, при которых можно успешно применять предложенный тест для квалификации хроматографических колонок для ионной и гидрофильной ВЭЖХ на основе силикагеля. 

 

 

Введение

 

В первой статье серии авторы сформулировали термин «квалификация хроматографической колонки» для обозначения высокоинформативных тестов ВЭЖХ-колонок, позволяющих наиболее полно описать их физико-химические и эксплуатационные свойства: величину удерживания по доминирующему механизму, селективность, химическую инертность, эффективность[1]. Также был предложен оригинальный тест для квалификации обращенных и смешанных фаз с доминированием обращенно-фазового механизма, с помощью которого можно установить все перечисленные характеристики. При этом, инновационной составляющей было разделение селективности на два ортогональных параметра, связываемых с примесями минорных ВЭЖХ-режимов: гидрофильного (HILIC) и переносно-зарядного (CT).

Данная работа посвящена описанию второго оригинального теста ВЭЖХ-колонок, который предназначен для квалификации любых полярных колонок на основе силикагеля, применяемых в комбинации с водно-органическими подвижными фазами. В этом случае механизм удерживания всегда представляет собой смесь двух хроматографических режимов: гидрофильного и ионного.

И ионная, и гидрофильная хроматографии – два сильно неоцененных вида ВЭЖХ для фармацевтических приложений. Упрощенно можно считать, что удерживание в ионном режиме определяется зарядом адсорбата, а в гидрофильном – общим числом заряженных групп в его составе. Учитывая, что большинство фармацевтических препаратов – это заряженные соединения (органические соли), то область применения для гидрофильной и ионной хроматографии в фармацевтике, биотехнологии, химии природных соединений должна быть, по крайней мере, не хуже, чем для обращенно-фазовой хроматографии.

Тем не менее, на практике новые гидрофильные и ионные методы разрабатываются пока сравнительно нечасто, а внедряются и успешно применяются – еще реже. На это есть целый ряд причин, совершенно не связанных с самими методами, но имеющих прямое отношение к недостаточному пониманию аналитиками их особенностей и «подводных камней».

К этому же ряду причин можно причислить и отсутствие у аналитика инструментов, которые позволили бы сравнивать физико-химические свойства гидрофильных и ионных неподвижных фаз различных типов и производителей, а также судить об их качестве и воспроизводимости свойств от партии к партии.

Цель работы состоит в том, чтобы продемонстрировать возможность квалификации применяемых на практике гидрофильных и ионных ВЭЖХ-колонок на основе силикагеля с помощью теста, разработанного специалистами нашей компании.

 

 

Экспериментальная часть

 

Соотношение двух составляющих смешанного гидрофильно-ионного механизма в каждом конкретном случае определяется как химией неподвижной фазы и составом подвижной фазы, так и свойствами адсорбатов, из которых составлена тестовая смесь. Тем не менее, основной параметр, контролирующий это соотношение – доля ацетонитрила в подвижной фазе. Вклад ионного механизма растет с ее уменьшением, а вклад гидрофильного механизма растет с ее увеличением.

Таким образом, содержание ацетонитрила в подвижной фазе контролирует не только (и не столько) удерживание, сколько, в первую очередь, селективность разделения. Варьирование доли ацетонитрила вызывает наиболее выраженное изменение селективности с изменением порядка элюирования в том случае, когда адсорбаты содержат и основные, и кислотные функциональные группы. Действие этого фактора более мягкое, если тестовая смесь состоит из одноосновных органических оснований и кислот, и почти не выражено, если тестовая смесь состоит из органических ионов с одинаковым знаком заряда.

Из этого наблюдения следуют два вывода, важных для разработки тестовой системы. Во-первых, выборка адсорбатов не должна содержать амфотерных органических соединений, поскольку это привело бы к недостаточной робастности тестового разделения и, соответственно, неустойчивости самого теста. С другой стороны, выборка не может состоять только из соединений одного знака заряда, поскольку такой тест мог бы работать только для одного типа ионита (катионита или анионита). Кроме того, среди тестовых адсорбатов должны быть и нейтральные соединения, по которым можно было бы судить об удерживании только по гидрофильному механизму.

Таким образом, тестовая смесь должна состоять из гидрофильных нейтральных соединений, органических оснований и органических кислот.

Во-вторых, тест должен проводиться в условиях, которые бы априори гарантировали смешанный режим с сопоставимыми по величине вкладами обоих механизмов, гидрофильного и ионного. Сопоставимость теста, как со слабыми, так и с сильными ионитами требует значения рН буфера, близкого к нейтральному.

Что касается доли ацетонитрила в подвижной фазе, то она не должна быть слишком низкой, порядка 50% или менее, поскольку в подобных условиях гидрофильный механизм подавляется почти полностью. Существенное влияние гидрофильного механизма для удерживания однозарядных органических ионов начинается приблизительно от 70%. В то же, время, содержание ацетонитрила не должно быть слишком высоким, 85% и более, поскольку в таких условиях подавляется ионный механизм, а форма пиков ионных соединений недопустимо искажается.

В результате, для проведения тестирования была выбрана подвижная фаза, состоящая из  ацетонитрила и 20 мМ водного раствора формиата аммония, смешанных в объемном отношении 80:20.

В тестовую смесь включили следующие соединения (в порядке элюирования на катионите): (1) сахарин, (2) бензойная кислота, (3) кофеин, (4) аскорбиновая кислота, (5) пиридоксин, (6) серотонин. Кофеин – нейтральное соединение; сахарин, бензойная кислота и аскорбиновая кислота – кислоты, пиридоксин и серотонин – основания.

Детектирование проводили при помощи диодно-матричного или двухволнового сканирующего УФ-детектора на двух длинах волн – 230 нм (синяя линия на рисунках) и 270 нм (красная линия на рисунках).

Для каждой тестируемой колонки необходимо предварительно измерить нулевое (мертвое) время; в нашей работе для этих целей применяли нафталин.

 

 

Обсуждение результатов

 

На рис. 1 приведены три хроматограммы тестовой смеси, полученные на сильном катионите, слабом катионите и слабом амионите. На катионитах наиболее удерживаемым адсорбатом является серотонин – сильное основание. На анионитах последний пик – всегда аскорбиновая кислота, одинаково сильно удерживающаяся как по анионообменному, так и по гидрофильному механизмам.

На сильном катионите сахарин элюируется до нулевого времени, что не является ошибкой – в этом случае вклад ионной эксклюзии для сахарината превосходит его удерживание по гидрофильному механизму.

В целом, закономерность в порядке элюирования адсорбатов хорошо прослеживается: при переходе от сильного катионита к слабому, а затем к аниониту удерживание оснований возрастает, а удерживание кислот падает – из-за влияния ионного механизма.

При этом на удерживание кофеина влияет только гидрофильность применяемой неподвижной фазы, но не ее заряд.

Таким образом, коэффициент удерживания кофеина может служить параметром для оценки удерживающей способности неподвижной фазы по гидрофильному механизму безотносительно ее заряда.

 

 

 

Рис. 1. Хроматограмма тестовой смеси, полученной на а) сильном катионите, б) слабом катионите и в) слабом амионите

 

 

В то же время, для оценки знака и величины заряда полярной неподвижной фазы был применен параметр, вычисляемый следующим образом:

           

Фактор заряда = (tR(серотонин) – tR(сахарин)) / t0, где

 

  • tR(серотонин) – время удерживания серотонина,

  • tR(сахарин) – время удерживания сахарина,

  • t0 – нулевое время.   

 

На рис. 2 приведен график, каждая точка на котором соответствует определенной неподвижной фазе; по оси абсцисс отложен фактор заряда, вычисленный по приведенной выше формуле, а по оси ординат – коэффициент удерживания кофеина.

Из графика хорошо видно, что нулевой заряд подвижной фазы соответствует значению фактора заряда около единицы; анионитам (положительный заряд) соответствует область значений менее единицы, катионитам (отрицательный заряд) – более единицы.

Таким образом, тест можно применять для сравнения гидрофильности различных полярных неподвижных фаз, а также величин заряда катионитов и анионитов.

 

 

 

Рис. 2. График зависимости коэффициента удерживания кофеина от фактора заряда

 

Еще одно преимущество теста – возможность оценки и сравнения качества полярных колонок различных производителей. Химическую инертность целесообразно оценивать по коэффициенту асимметрии пиридоксина. На «загрязненных» примесями металлов, некачественных силикагелях пик пиридоксина становится асимметричным, в то время как на чистых, качественных силикагелях он симметричен. Эффективность упаковки колонки можно проверять по пику аскорбиновой кислоты (см. рис. 1).

 

 

 

 

 

Рис. 3. Хроматограмма тестовой смеси, состоящей из мочевины[ВB1] , 5-метилфурфурола, никотинамида, пиридоксина и серотонина

 

К сожалению, предложенный тест не применим для характеризации смешанных обращенно-ионных неподвижных фаз с неполярным энд-кеппингом. На рис. 3 приведен пример хроматограммы тестовой смеси, которая может применяться для квалификации смешанных обращенных-катионообменных фаз такого типа.

Смесь включает мочевину, 5-метилфурфурол, никотинамид и пиридоксин (слабые основания), серотонин (сильное основание). Подвижная фаза состоит из ацетонитрила и 50 мМ водного раствора однозамещенного фосфата аммония, смешанных в объемном отношении 23:77.

Величину удерживания по обращенно-фазовому механизму можно оценить по коэффициенту удерживания 5-метилфурфурола, эффективность упаковки – по пику 5-метилфурфурола, величину положительного заряда – по коэффициенту удерживания никотинамида, химическую инертность – по коэффициенту асимметрии пика пиридоксина. Нулевое время можно измерять по любому нейтральному гидрофильному соединению, например, по мочевине.

 

 

Выводы

 

Применение оригинального метода тестирования полярных колонок на основе силикагеля в условиях реализации ионной, гидрофильной и смешанной ионной-гидрофильной ВЭЖХ позволяет оценивать и сравнивать их физико-химические и эксплуатационные характеристики:

  • удерживание по гидрофильному механизму,

  •  знак и величину заряда ионита, определяющих удерживание в ионной хроматографии и селективность в смешанной  ионной-гидрофильной ВЭЖХ,

  •  химическую инертность полярных неподвижных фаз на основе силикагеля,

  •  эффективность упаковки полярных колонок.

Тест пригоден для квалификации хроматографических колонок для ионной и гидрофильной ВЭЖХ на основе силикагеля. 

 

 

Применение ионной ВЭЖХ в фармацевтическом анализе: контроль качества лекарственных средств, скрининг и выделение примесей, фармакокинетические исследования   

 

К.С. Сычев*, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

В статье показаны примеры применения ионной хроматографии для фармацевтического анализа, а также приведено резюме преимуществ ионных разделений для лабораторий ОКК и НИР на фармацевтических производствах.

 

 

Введение

 

В настоящее время ионная жидкостная хроматография является наиболее недооцененной ВЭЖХ техникой для фармацевтического анализа.

Как правило, ионная хроматография прочно ассоциируется с неорганическими анионами и кондуктометрическим детектированием. В то же время, ионный принцип разделения отлично подходит для разделения любых органических ионов на стандартном ВЭЖХ оборудовании с УФ, флуориметрическим или рефрактометрическим детекторами.

Подавляющее большинство фармацевтиков в водных средах с рН от нейтрального до кислого являются органическими ионами. Таким образом, потенциал ионной хроматографии для фармацевтического анализа огромен, а ее реальное применение, судя по EP и USP, ограничено единичными приложениями. Почему так произошло?

Если начать разбираться в этой ситуации, то окажется, что на самом деле порядка 20% фармакопейных методик выполнено в режиме ионной хроматографии. Это не бросается в глаза, поскольку для анализа применяют формально обращенные фазы, применяемые в комбинации с подвижными фазами, содержащими ионные ПАВ – так называемые ион-парные добавки. Любой «тяжелый» ион-парный реагент (С6-С10 сульфонаты, ТБА и т.д.) фактически превращает обращенную фазу в ионную; этот процесс называется динамическим модифицированием.

Итак, ионная хроматография применяется в фармацевтике, но основным способом ее реализации является ион-парная хроматография. Как это произошло? какими преимуществами и недостатками обладает ион-парная хроматография?

Ответ на первый вопрос уходит корнями в 80-е и 90-е годы, в течение которых ВЭЖХ внедрялась в фармацевтический анализ наиболее активно, и когда были созданы большинство фармакопейных разделений. Компании, производящие ВЭЖХ колонки, боролись за открывшийся огромный рынок сбыта. При этом успех таких компаний в основном определялся выводом на рынок более совершенных обращенно-фазовых (ОФ) колонок, закрывающих до 80% всех аналитических задач. Таким образом, рынок почти полностью состоял только из обращенных фаз, а задача по решению остальных 20% задач, для которых ОФ хроматография не подходила, легла на плечи разработчиков ВЭЖХ методик.

И они сделали то, что можно было сделать в той ситуации – приспособили обращенные фазы для нужд ионной хроматографии. Тем более, что преимуществом ион-парной хроматографии (по всей видимости, единственным) является возможность при наличии времени и «золотых рук» достичь почти любой необходимой селективности, то есть расположить пики на хроматограмме любым требуемым образом.

К сожалению, «золотые руки» не масштабируются, и для многих лабораторий ОКК ион-парные разделения являются постоянным кошмаром, не позволяющим нормально работать и выдавать стабильные результаты.

Ион-парные разделения очень плохо воспроизводятся, а на кондиционирование колонок могут уходить дни. Аналитик никогда не уверен, сможет ли он получить стабильный результат в следующий раз, или нет, и сколько на этой уйдет времени – а это совершенно недопустимо для заводской  лаборатории как звена производственной цепочки, в условиях непрерывного производства.

Сами реагенты дороги, их расход велик. Ион-парные системы генерируют множество мешающих определению системных сигналов, накладывают серьезные ограничения на состав дилюента для проб, несовместимы с масс-селективными и испарительными детекторами – список недостатков можно продолжать и продолжать.   

Таким образом, ион-парная хроматография – это вынужденная мера, которая была вызвана недостатком хороших ионных колонок и непониманием базовых принципов работы с ними. Такая ситуация во многом сохраняется и по сей день.

В меньшей степени это касается доступности ионных неподвижных фаз, их выпускают многие компании. В последнее время на рынке также начали появляться ионные фазы на основе поверхностно-пористого силикагеля (core-shell).

Гораздо хуже дело обстоит с пониманием принципов работы с ионными фазами на основе силикагеля. Ключевым моментом здесь является неосведомленность о том, что, в отличие от обращенно-фазовой хроматографии, в ионной (а также гидрофильной, HILIC) хроматографии качество ионного разделения во многом определяется правильной промывкой и кондиционированием колонки.

Попытка поставить «свежую» ионную колонку, заполненную изопропанолом, на анализ без проведения ее предварительной обработки неизбежно приведет к достаточно посредственному результату – пики будут в большей или меньшей степени асимметричны.    

Перед применением ионной колонки на основе силикагеля из нее необходимо вытеснить изопропанол ацетонитрилом, а затем тщательно промыть колонку смесью ацетонитрила с водным буферным раствором в соотношении 1:1. Состав буферного раствора будет зависеть от состава применяемой подвижной фазы и обменой емкости ионной неподвижной фазы.

К примеру, сильные катиониты (SCX) на основе силикагеля, обладающие большой емкостью, перед применением целесообразно обрабатывать в достаточно жестких условиях. Для обработки подходит смесь ацетонитрила с буфером в соотношении 1:1, где в качестве буфера применяют 50мМ водный раствор однозамещенного фосфата аммония с добавкой 0.5% фосфорной кислоты. В результате нескольких часов обработки такой смесью негативное влияние микропор силикагельного материала в значительной мере подавляется, и пики становятся значительно более симметичными.

Для улучшения симметрии пиков также можно применять повышение температуры колонки до 40-45°С. В этом случае для хроматографии на традиционных потоках 1.0-1.5 мл/мин нужен хороший – равномерный и быстрый – прогрев подвижной фазы перед входом в колонку.  

Например, стандартный термостат ВЭЖХ колонок можно дополнить теплообменником «нулевого мертвого объема», позволяющий прогревать подвижную фазу до требуемых температур при объемной скорости потока до 1-3 мл/мин без видимого ухудшения эффективности и симметрии.

 

Экспериментальная часть

 

Для хроматографического разделения применяли сильный катионит I.B.S.pharm MA размера 250х4.6, упакованный 3мкм частицами (I.B.S., Эстония). Неподвижная фаза поставляется уже промытой и откондиционированной, то есть готовой к применению без каких-либо дополнительных действий. 

Эксперимент проводили на жидкостном хроматографе Sykam S600 (Sykam, Германия), укомплектованным сканирующим спектрофотометрическим детектором S3250, градиентным бинарным насосом S1132 HP, автосамплером S5300 со сборкой жидкостной системы в варианте для ионной хроматогрфии (I.B.S., Эстония), включающем контактный термостат колонок с высокоэффективным теплообменником.

 

Результаты и обсуждение

 

Неподвижная фаза I.B.S.pharm MA предназначена для определения органических низкомолекулярных соединений, либо одноосновных, либо амфотерных соединений основного характера, заряд которых в кислой среде не превышает +1.

К подобным соединениям можно отнести многие препараты для лечения заболеваний сердечнососудистой системы (бета-адреноблокаторы, блокаторы кальциевых каналов, антиаритмические средства, катехоламины), нервной системы (антидепрессанты группы СИОЗС, антипсихотические препараты – производные фенотиазина и пиперидина), дыхательной системы (бета-адреномиметики), антибиотики (амоксициллин, тилозин, тетрациклины и т.д.)

На рисунке 1 приведена обзорная хроматограмма фармацевтических соединений различных классов, которые могут быть определены на сильном катионите.

 

 

Рисунок 1. Изократическое разделение сальметерола (1), дротаверина (2), дифенгдрамина (3), декстрометорфана (4), псевдоэфедрина (5) и кодеина (6) на фоне матрицы содежащих их комбинированных препаратов.

 

Из этой рисунка видно основное отличие ионной хроматографии от обращенно-фазовой – объемный гидрофобный фрагмент не повышает удерживание, а умеренно понижает. В результате, любые однозарядные органические катионы различной гидрофобности элюируются в одном окне в изократических условиях.

 

Рисунок 2. Определение фениэфрина в сиропе с загустителем – ксантановой камедью – в изократических условиях методими обращенно-фазовой (А) и ионной (В) хроматографии. В отличие от ионного, обращенно-фазовое разделение демонстрирует низкую специфичность. При этом обащенно-фазовая колонка загрязняется компонетами матрицы образца, а на ионной колонке вся камедь эюируется в начале хроматограммы и не загрязняет колонку.

 

По сравнению с обращенной фазой, главным преимуществом ионного режима является высокая специфичность. Определение целевых основных фармацевтиков можно проводить в сложных матрицах напрямую, зачастую без пробоподготовки (см. рис. 2). При этом гидрофобные низко- и высокомолекулярные компоненты матрицы не загрязняют колонку и не мешают определению – что в принципе невозможно при использовании обращенно-фазовой хроматографии.

Ионный режим позволяет специфично определять в любых сложных матрицах, например, биообразцах, остаточные количества антибиотиков (см. рис 3 и 4).

 

 

Рисунок 3. Изократическое разделение доксициклина (1) и окситетрациклина (2).

 

 

Рисунок 4. Изократическое разделение тилозина А (1) и тилозина В (2).

 

Это можно делать как с применением УФ детектора, так и применением высокочувствительного флуореметрического детектирования после пост-колоночной дериватизации любым подходящим реагентом.

          Таким образом, в случае однозарядных целевых фармацевтиков и их метаболитов (первичных и вторичных аминов, карбоновых кислот) ионная хроматография в сочетании с пост-колоночной дериватизацией и флуореметрическим детектированием может применяться для фармакокинетическх исследований, составляя серьезную конкуренцию методу ВЭЖХ-МС.

 

Ионная хроматография может применяться не только для контроля качества лекарственных средств, но и БАДов; в примеру, ряд водорастворимых витаминов (см. рис. 5) и бетаинов (см. рис. 6) также могут быть определены в ионном режиме.

 

 

Рисунок 5. Изократическое разделение никотиновой кислоты (1), никотинамида (2) и пиридоксина (3).

 

 

Рисунок 6. Изократическое разделение бетаина (1), кротонового бетаина (2) и карнитина (3) на фоне матрицы напитка-энергетика.

 

Выводы

 

Ионные разделения отлично подходят для нужд лабораторий ОКК. Можно выделить три основные преимущества ионной хроматографии при рутинных определениях на потоке.   

 

Преимущество 1. Результаты очень стабильны. Времена удерживания не «плывут», это нехарактерно для ионной хроматографии.

Преимущество 2. Разделения очень робастны. Небольшие погрешности в приготовлении подвижной фазы никак не влияют ни на селективность, ни на удерживание, ни на разрешение.

Преимущество 3. Никакие гидрофобные соединения, включая нейтральные ПАВ и полимеры, не удерживаются в ионном режиме.

Следствие 3.1. При анализе мазей, пластырей, гелей, сиропов и т.д. не требуется пропободготовка.

Следствие 3.2. Колонка не загрязняется и не выходит из строя по этой причине.

Следствие 3.3. Применение ионной хроматографии не требует предколонок, если только матрица образца не содержит заряженные компоненты, по знаку совпадающие с целевыми соединениями.

 

По такому же принципу можно выделить два основные преимущества ионной хроматографии для лабораторий НИР при разработке ВЭЖХ методик и при проведении исследований. 

 

Преимущество 4. Удерживание в ионной хроматографии легко предсказывать – даже проще, чем в обращенно-фазовой хроматографии. Соединения со сравнимыми по величине зарядами одного знака элюируются в изократических условиях в одном окне. При этом удерживание уменьшается при увеличении гидрофобного участка молекулы.

Следствие 4.1. По сути, определение на ионите является готовым решением для любой ВЭЖХ методики количественного определения основного действующего вещества, если в нейтральных или кислых условиях оно имеет заряд, не превышающий единицы. 

Следствие 4.2. Разделения в ионном режиме являются разделениями с групповой селективностью. Групповая селективность – это свойство хроматографической системы элюировать соединения определенного класса в одном окне, причем с очень высокой специфичностью. Групповая селективность необходима для скрининговых исследований образцов неизвестного состава (в фармацевтике такие задачи называются drug screening).

Ионная хроматография позволяет селективно выделять из комплексного образца, проявляющего биологическую активность, все соединения, имеющие определенный заряд, и далее исследовать их отдельно.

 

Преимущество 5. В ионной хроматографии на силикагельных фазах последние демонстрируют отличную нагружаемость (loadability).  Следствие 5.1. В ионной хроматографии на силикагельных фазах можно добиваться весьма низких пределов определения, причем простым способом – за счет увеличения кнцентрации пробы и ее инжектируемого объема.

Следствие 5.2. Ионные разделения легко масштабируются. Сочетание высокой нагружаемости и групповой селективности делает ионную хроматографию отличным выбором для препаративного выделения различных биологически активных компонентов и примесей с целью их дальнейшего изучения.

 

Об авторе

 

Константин С. Сычев – автор пяти книг и более трех десятков работ по ВЭЖХ и подготовке пробы с более чем двадцатилетним опытом в области ВЭЖХ и разрабоки ВЭЖХ методик.

В начале карьеры работал под руководством одного из наиболее известных мировых ученых в области ВЭЖХ, лауреата наград Мартина-Синджа и Нернста-Цвета Вадима А. Даванкова и получил научную степень за работы в области исследования новых неподвижных фаз и развитие методологии исследования механизмов удерживания. Основное научное достижение – строгое доказательство связи удерживания в режиме «с переносом заряда» (charge transfer HPLC) с параметрами π-системы удерживаемых соединений.

С 2008 года – индивидуальный предприниматель, специализиующийся на проведении корпоративных курсов по ВЭЖХ и разработке ВЭЖХ методик. С 2017 года – директор компании Integrated BioSeparation Solutions, Эстония (I.B.S., www.hplc.today, www.hplc.today/rus). Основная деятельность компании – разработка ВЭЖХ методик и поставка кастомизированных ВЭЖХ комплексов на базе оборудования Sykam (Германия), а также брендовых ВЭЖХ колонок линеек I.B.S.pharm и I.B.S.nutri.

 

Применение ВЭЖХ для анализа энергетических масел и присадок

К.С. Сычев*, Е.А. Окунская*

* Integrated BioSeparation Solutions, Estonia. www.hplc.today, sales@hplc.today

Статья посвящена обзору аттестованных аналитических подходов на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии, применяемых для анализа энергетических масел и присадок. Преимущества современных модернизированных ВЭЖХ-методик проиллюстрированы примерами определения целевых соединений в реальных образцах.  

 

 

До недавнего времени применение высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в энергетике было ограничено всего одной-двумя задачами. К счастью, этот широко распространенный аналитический метод сегодня используется для решения задач энергетики все чаще и чаще.

В РФ с 1994 года ВЭЖХ стала основным методом анализа трансформаторных масел для определения в них четырех фурановых производных – маркеров деградации бумажной изоляции [1]. Более ранняя методика на основе газовой хроматографии (ГХ) давала неправильные результаты по причине невоспроизводимой деградации целевых соединений в испарителе газового хроматографа.

Согласно утвержденному РАО «ЕЭС» документу [1], определение проводится методом обращенно-фазовой ВЭЖХ; при этом перевод аналитов из рабочего минерального масла в пробу осуществляется жидкостной экстракцией в фазу ацетонитрила. Приведенная методика обеспечивает приемлемые (более 0,9) значения степеней извлечения, однако при этом обладает двумя существенными недостатками:

  • полученные пробы сильно загрязнены углеводородами масла, что приводит к быстрому выходу обращенно-фазовых хроматографических колонок из строя даже при их регулярных промывках ацетонитрилом;

  • степени извлечения аналитов сильно зависят от состава образца, то есть от марки масла и степени его износа, порой отличаясь на десятки процентов.

Таким образом, методика дает, строго говоря, полуколичественные результаты.

При непосредственном участии авторов статьи описанная выше методика была дважды модернизирована. В 2002 году для преодоления первой проблемы был изменен состав экстрагента [2]: вместо ацетонитрила экстракция проводилась подвижной фазой, то есть смесью ацетонитрила с водой в объемном отношении 15:85. В результате чистота проб получалась вполне приемлемой, и для нормальной эксплуатации хроматографических колонок было достаточно периодически, через каждый десяток анализов, промывать их ацетонитрилом. Потери эффективности разделения в этом случае не происходило, так как проба и подвижная фаза совпадали по составу. Основным недостатком подобной методики являлись низкие (порядка 0,5) значения степеней извлечения.

В 2007 году от подготовки пробы методом жидкость-жидкостной экстракции авторы отказались полностью [3] в пользу твердофазной экстракции (ТФЭ), что позволило значительно улучшить воспроизводимость и повысить количество извлеченных фурановых производных из различных образцов эксплуатационных масел, а также ускорить проведение анализа до двух минут.

В качестве адсорбционного материала для ТФЭ предложен сверхсшитый полистирол, способный эффективно поглощать ароматические соединения из неполярных сред (на основе предельных углеводородов) с последующей легкой десорбцией водноорганическими смесями. Свойства материала обусловлены тем, что нейтральный сверхсшитый полистирол в неполярных средах селективно взаимодействует с адсорбатами преимущественно за счет образования лабильных комплексов с переносом заряда π-π типа, а в полярных органических растворителях ведет себя как типичный гидрофобный обращенно-фазовый адсорбент [4, 5]. 

Показано, что основное преимущество методики – высокая чистота получаемых проб, что делает ее незаменимой при рутинных анализах трасформаторного масла. Предел определения каждого производного фурана не превышает 30 мкг/л. Коэффициенты извлечения для фурфурола, 2-ацетилфурана и 5-метилфурфурола превышают 95%, для 5-гдроксиметилфурфурола находятся в интервале 75–80% (табл. 1).

 

Таблица 1. Средние степени извлечения четырех фурановых производных для двух различных образцов товарного трансформаторного масла с добавками целевых соединений на уровне 1000 мкг/л

 

Соединение

Степень извлечения ± СКО, %

Образец № 1

Образец № 2

5-Гидроксиметилфурфурол

 

76,5 ± 1,3

 

 

79,5 ± 0,4

 

Фурфурол

 

99,0 ± 0,5

 

 

93,9 ± 0,6

 

2-Ацетилфуран

 

95,2 ± 1,1

 

 

95,5 ± 1,2

 

5-Метилфурфурол

 

98,3 ± 0,9

 

 

98,4 ± 0,8

 

 

Подготовку пробы проводили по следующей схеме. К 2 мл отстоявшегося трансформаторного масла добавляли 8 мл гексана. Полученный раствор (10 мл) пропускали под вакуумом водоструйного насоса со скоростью не более 2 мл/мин через 20×8 картридж со сверхсшитым полистиролом Purosep200. Картридж промывали 2 мл чистого гексана при соблюдении той же скорости, затем оставляли под вакуумом на просушку в течение 2 минут. Аналиты смывали 2 мл смеси ацетонитрил-вода 1:1, в элюат добавляли 1 мл воды. Полученную пробу анализировали методом ВЭЖХ на обращенно-фазовой С18-колонке типоразмера 50×4 с 3 мкм адсорбентом; подвижная фаза ацетонитрил-вода 12,5:87,5 (об.), скорость потока 0,6 мл/мин, детектирование – УФ (285 нм), время анализа – 2,5 минуты.

Для определения присадок в энергетических маслах метод ВЭЖХ в РФ стали применять с 1997 года [6], когда его предложили для определения ингибитора окисления 2,6-дитретбутил-4-метилфенола (Агидол-1).

При участии авторов статьи в 2013 году методика была модернизирована [7], в результате значительно повысились такие ее характеристики, как специфичность (за счет увеличения разрешающей способности), робастность, производительность. Определение присадки Агидол-1 стало возможно проводить не только в товарных, но и в отработанных маслах – за время, не превышающее четырех минут (рис. 1).

 

 

Рис. 1. Определение присадки Агидол-1 (пик № 1) в образце отработанного трансформаторного масла. Неподвижная фаза: 250×4,6 Nanospher-A1 C18. Подвижная фаза: ацетонитрил

 

 

Отличительная особенность методики [7] состоит в применении для ВЭЖХ-анализа неподвижной фазы со значительной гидрофобностью. Тогда можно в качестве подвижной фазы применить чистый ацетонитрил, то есть сам экстрагент. В результате неподвижная фаза не загрязняется неполярными компонентами матрицы (минерального масла).

Определение проводят на колонке 250×4,6 Nanospher-A1 C18 5 мкм, или аналогичной колонке на основе силикагеля с С18-прививкой, неполярным эндкеппингом и повышенной (25%) долей углерода; подвижной фазой является ацетонитрил, скорость потока 2 мл/мин, детектирование – УФ 280 нм.

Также при участии авторов в 2013 году разработаны методики определения в турбинных маслах деактивирующих присадок на основе бензотриазола: Бетол-1 и Иргамет-39 [8], а также деактивирующей присадки Иргамет-30 на основе триазола [9]. Применение специализированных ВЭЖХ-фаз позволило разделить и определять по отдельности различные позиционные изомеры активного компонента присадки Иргамет-39 (рис. 2).  

В качестве эстрагента применяли не традиционный ацетонитрил, а водный раствор фосфорной кислоты (для Бетол-1 и Иргамет-39 – 1%-ный, а для Иргамет-30 – 0,1%-ный), что позволило селективно извлекать из образцов масел целевые соединения, не загрязненные попутно компонентами матрицы.

Определение активных компонентов присадок Бетол-1 и Иргамет-39  проводили на колонке 250×4,6 Nanospher-A3 PFP 5 мкм или аналогичной колонке на основе силикагеля с пентафторфенильной или пиренильной прививкой и неполярным эндкеппингом; подвижная фаза – вода-ацетонитрил-фосфорная кислота 85:15:0,1; температура колонки – 45 °С, скорость потока 2 мл/мин, детектирование – УФ 280 нм.

 

 

Рис. 2. Определение активных компонентов присадок Бетол-1 (пик № 1) Иргамет-39 (пик № 2) в экстрактах товарных масел на стандартной С18 и специализированной С18-фазах. Неподвижная фаза: (внизу) 250×4,6 Reprosil-Pur Basic C18, (вверху) 250×4,6 Nanospher-A3 PFP. Подвижная фаза: вода-ацетонитрил-фосфорная кислота 85:15:0,1. Температура: 45°С

Определение активных компонентов присадки Иргамет-30 проводили на колонке 250×4,6 Nanospher-A2 C30 5 мкм, или аналогичной колонке на основе силикагеля с С30 прививкой и неполярным эндкеппингом. Подвижная фаза – (0,5мМ водный раствор децилсульфоната натрия)-ацетонитрил-фосфорная к-та 94:6:0,1; допускается варьирование доли ацетонитрила от 0 до 10 объемных долей (от состава 100:0:0,1 до состава 90:10:0,1), пока выполняются критерии пригодности хроматографической системы. Температура колонки – 30 °С, скорость потока 2 мл/мин, детектирование – УФ 200 нм.

Помимо анализа энергетических масел, метод ВЭЖХ пригоден для прямого анализа товарных присадок к ним. Следует отметить, что для выявления корреляции между эксплуатационными характеристиками присадок и их хроматографическим поведением также требуется разработка специальных ВЭЖХ-методик; нередко применение простого и «традиционного» подхода в этом вопросе бывает неприменимо.

Яркий пример – сравнительное исследование различных марок антикоррозионных присадок (В15/41 и Irgacor L12) двумя различными видами ВЭЖХ: обращенно-фазовой и эксклюзионной (рис. 3). Более «традиционная» обращенно-фазовая ВЭЖХ в данном случае малоинформативна, в то время как проведение редко применяемого варианта эксклюзионной ВЭЖХ на микропористой неподвижной фазе четко выявляет более узкое молекулярно-массовое распределение и более высокую молекулярную массу активного компонента присадки Irgacor L12 [10]. 

Обращенно-фазовое разделение проводили на колонке 100×4,6 SunShell C18 2,6 мкм; подвижная фаза – ацетонитрил-вода 50:50, скорость потока 1 мл/мин. Эксклюзионное разделение проводили на полигидроксиметакрилатной колонке 250×4,6 Shodex ODP-2E 5 мкм; подвижная фаза – ацетонитрил, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование – УФ 210 (синяя линия) и 260 нм (красная линия).  

 

Рис. 3. Анализ присадок В15/41 и Irgacor L12 в более «традиционном» обращенно-фазовом режиме (слева) и в эксклюзионном режиме (справа)   

 

 

Литература

1. Медведева Р.Л., Костиков С.Ю., Спорыхин С.А., Соловьева Л.В.  Методика количественного химического анализа. Определение содержания производных фурана в электроизоляционных маслах методом жидкостной хроматографии. РД 34.43.2-6-94 // ОРГРЭС Москва 1995.

2. Сычев С.Н., Кострубин М.М., Сычев К.С. Определение производных фурана в электроизоляционных маслах методом ОФ ВЭЖХ с применением хроматографов серии «Милихром» // Заводская лаборатория. 2002. Т. 68. № 9. С. 19–21.

3. Проскурина Н.А., Ильин М.М., Даванков В.А., Сычев К.С., Костиков С.Ю. Применение твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле при определении фурановых производных в трансформаторных маслах // Журнал физической химии. 2007. Т. 81. № 3. С. 502–506.

4. К.С. Сычев, В.А. Даванков. Материалы и методы пробоподготовки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка // Сорбционные и хроматографические процессы. 2004. Т.4. Вып.1. C. 5–28.

5. C.S. Sychov, V.A. Davankov, N.A. Proskurina, A.Ju. Mikheeva. The Unique Selectivity of π-Interactions for SPE. // LC&GC Europe. 2009. V. 22. № 1. P. 20–27.

6. Костиков С.Ю., Медведева Р.Л., Шуварин Д.В., Спорыхин С.А., Соловьева Л.В. Методика количественного химического анализа. Определение содержания присадок в энергетических маслах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. РД 34.43.208-95 // ОРГРЭС Москва 1997.

7. Методика измерений массовой доли ингибитора окисления 2,6-дитретбутил-4-метилфенола (Агидол-1) в турбинных маслах АЭС. Свидетельство об аттестации методики измерений № 01.00225/205-35-13.

8. Методика измерений массовой доли деактивирующих присадок на основе производных бензотриазола (Бетол-1, Иргамет-39) в турбинных маслах АЭС. Свидетельство об аттестации методики измерений № 01.00225/205-36-13.

9. Методика измерений массовой доли деактивирующих присадок на основе производного триазола (Иргамет-30) в турбинных маслах АЭС. Свидетельство об аттестации методики измерений № 01.00225/205-41-13.

Статьи компании по жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с 2003-2009 гг.

К.С. Сычев, В.А. Даванков. Материалы и методы пробоподготовки в хроматографии: твердофазное концентрирование и адсорбционная очистка. Обзор. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2004. Т.4. №1. C. 5-28.

Проскурина Н.А., Даванков В.А., Ильин М.М., Ильин М.М.(мл.), Сычев К.С. Определение полиядерных ароматических углеводородов в жиросодержащих продуктах питания с использованием селективной твердофазной экстракции. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т.9. №2. С. 167-176.

 

Михеева А.Ю., Васильева И.А., Семенов С.Ю., Сычев К.С. Применение многослойных колонок для проведения экспрессной адсорбционной очистки экстракта при определении хлорорганических пестицидов. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т.9. №1. С. 80-88.

Н.А. Проскурина, М.М. Ильин, В.А. Даванков, К.С. Сычев, С.Ю. Костиков. Сочетание твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле с ВЭЖХ-определением фурановых производных в трансформаторных маслах. // Журнал физической химии. 2007. Т.81. №3. С. 1-5.

Сычев К.С., Зорин М.В. Разработка методики контроля содержания остаточных количеств пестицидов в растительных образцах. Часть 2. // Диагностика. Контроль. 2006. №2.
 

Сычев К.С., Эллер К.И., Даванков В.А. Определение микотоксина патулина во фруктах и соках методом НФ ВЭЖХ с применением твердофазной экстракции на сверхсшитом полистироле. // Заводская лаборатория. 2004. Т.70. № 10.

V.A. Davankov, C.S. Sychov, M.M. Ilyin, K.O. Sochilina. Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material - Mechanisms of retention. // Journal of Chromatography A 987(1-2):67-75 · March 2003.

C.S. Sychov, M.M. Ilyin, V.A. Davankov, K.O. Sochilina. Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high-performance liquid chromatography. // Journal of Chromatography A 1030(1-2):17-24 · April 2004.

C.S. Sychov, V.A. Davankov, N.A. Proskurina, A.Ju. Mikheeva. The Unique Selectivity of π-Interactions for SPE. // LC&GC Europe. 2009. V.22. №1. P. 20-27.

Сычев К.С. Применение сверхсшитого полистирола в ВЭЖХ и ТФЭ. Автореферат диссертации.